Биотехнологическая революция в здравоохранении и медицине началась с освоения технологии рекомбинантной ДНК (генетическая инженерия). Произошло это в начале 70-ых годов прошлого века и позволило ученым переносить генетический материал от одного организма к другому, минуя процесс полового размножения. Успех технологии рекомбинантных ДНК (рДНК) принесло использование бактериальных ферментов, таких как, например, рестрикционных эндонуклеаз (рестриктаз), которые разрезают молекулы ДНК в определенных местах; ДНК-лигаз, которые соединяют концы молекул ДНК; ДНК-полимераз, которые участвуют в репликации ДНК. Каким бы не было применение этой технологии, конечным итогом процедуры всегда является стабильная и наследуемая экспрессия какого-либо нового признака. Применяется рДНК для модификации различных организмов, но основные этапы работы схожи. Помимо плазмид также используются другие типы векторов -- бактериофаги, ретровирусы и космиды.
Использование биотехнологических решений и приемов для получения информации
Профилактика заболеваний; получение собственно лекарственных средств
Отличие медицинских биотехнологий от медицинских технологий. Понятие о биообъекте. Классификация биообъектов. Биообъекты в фармации, гигиене и санитарии. Перспективы биотехнологии в медицине.
Условия работы биообъектов в биотехнологических системах
Генетический контроль за функционированием биообъектов.
30.Бактериологический метод диагностики, его задачи и возможности
Бактериологический метод - основной метод диагностики инфекционных заболеваний. Включает в себя посев исследуемого материала на питательные среды, выделении чистой культуры и ее идентификацию( посев на плотные питатательные среды, на жидкие питательные среды, определение морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, антигенных, свойств, чувствительности к антибиотикам, количества микроорганизмов в исследуемом материале - определение вида и штамма микроорганизма.)
Исследуемый материал
v
I этап (нативный материал)
Микроскопия
Посев на среды обогащения или на плотные питательные среды
v
II этап (изолированные колонии)
Изучение культуральных, тинкториальных и морфологических свойств
Посев на скошенный питательный агар для выделение чистой культуры
v
III этап (чистая культура)
Идентификация выделенной культуры.
v
Заключение о выделенной культуре
Выделение чистой культуры основа бактериологической работы, т. к. в процессе деятельности приходится иметь дело с материалом, содержащим смесь микроорганизмов, а идентификация вида возможна тогда, когда бактерии получены в чистом, изолированном виде.
Для получения чистой культуры необходимо отделить клетки разных видов друг от друга.
Схема описания культуральных свойств микроорганизмов:
1.Форма колонии
2.Размер колонии
3.Цвет
4.Характер края
5.Характер поверхности
6. Консистенция
31.Вирусы как своеобразная форма жизни. Принципы классификации вирусов. Структура и химический состав вирусов. Особенности биологии вирусов. Репликация вирусных нуклеиновых кислот
Вирусы -- мельчайшие микробы, не имеющие клеточного строения, белоксинтезирующей системы, содержащие только ДНК или РНК. Относятся к царству Vira. Являясь облигатными внутриклеточными паразитами, вирусы размножаются в цитоплазме или ядре клетки. Они -- автономные генетические структуры. Отличаются особым -- разобщенным (дизъюнктивным) способом размножения (репродукции): в клетке отдельно синтезируются нуклеиновые кислоты вирусов и их белки, затем происходит их сборка в вирусные частицы. Сформированная вирусная частица называется вирионом.
Форма вирионов может быть различной: палочковидной (вирус табачной мозаики), пулевидной (вирус бешенства), сферической (вирусы полиомиелита, ВИЧ), в виде сперматозоида (многие бактериофаги). Различают просто устроенные и сложно устроенные вирусы.
Простые, или безоболочечные, вирусы состоят из нуклеиновой кислоты и белковой оболочки, называемой капсидом. Капсид состоит из повторяющихся морфологических субъединиц -- капсомеров. Нуклеиновая кислота и капсид взаимодействуют друг с другом, образуя нуклеокапсид.
Сложные, или оболочечные, вирусы снаружи капсида окружены липопротеиновой оболочкой (суперкапсидом, или пеплосом). Эта оболочка является производной структурой от мембран вирус-инфицированной клетки. На оболочке вируса расположены гликопротеиновые шипы, или шипики (пепломеры). Под оболочкой некоторых вирусов находится матриксный М-белок.
Капсид и суперкапсид защищают вирионы от влияния окружающей среды, обусловливают избирательное взаимодействие (адсорбцию) с клетками, определяют антигенные и иммуногенные свойства вирионов. Внутренние структуры вирусов называются сердцевиной.
Тип симметрии. Капсид или нуклеокапсид могут иметь спиральный, икосаэдрический (кубический) или сложный тип симметрии. Икосаэдрический тип симметрии обусловлен образованием изометрически полого тела из капсида, содержащего вирусную нуклеиновую кислоту (например, у вирусов гепатита А, герпеса, полиомиелита). Спиральный тип симметрии обусловлен винтообразной структурой нуклеокапсида (например, у вируса гриппа).
Включения -- скопление вирионов или отдельных их компонентов в цитоплазме или ядре клеток, выявляемые под микроскопом при специальном окрашивании. Вирус натуральной оспы образует цитоплазматические включения -- тельца Гварниери; вирусы герпеса и аденовирусы -- внутриядерные включения.
Химический состав вирусов отличается от других форм жизни необычайной простотой. Кроме геномной ДНК или РНК вирусы позвоночных содержат белки, масса которых составляет 57--90% массы вириона. Количество вирионных белков может колебаться в широких пределах в зависимости от сложности строения вируса. Среди белков, кодируемых вирусным геномом, различают структурные и неструктурные вирусспецифические белки. Первые входят в структуру вириона, вторые не входят. Структурными белками являются капсидные белки, белки оболочки и в некоторых случаях белки тегумента и ферменты. У многих вирусов некоторые структурные вирусные белки не являются первичными продуктами генов, а образуются в результате посттрансляционного расщепления полипептида-предшественника вирусспецифическими и клеточными протеазами.
Основные признаки, на которых базируется классификация вирусов:
1) характеристика нуклеиновой кислоты; тип (ДНК,РНК), число нитей в ней (одно- или двунитчатая), процентное содержание ее в вирионе, молекулярная масса, содержание гуанина и цитозина;
2) морфология вириона, тип симметрии, наличие внешних липопротеидных.оболочек, форма и размер вириона;
3) биофизические свойства вирусов и их химический состав (белки, липиды);
4) особенности репликации вирусов.
Существенное отличие механизма синтеза вирусных РНК от механизма синтеза клеточных РНК состоит в том, что в качестве матрицы в первом случае используется РНК, а во втором -- ДНК. Для транскрипции РНК на РНК-матрице необходима вирионная РНК-зависимая РНК-полимераза. Репликация вирусной РНК требует, прежде всего, синтеза комплементарной РНК, которая затем служит матрицей для производства большого количества вирусной РНК.
Интеграция -- внедрение вирусной (или другой) последовательности ДНК в геном клетки хозяина, приводящее к ковалентному соединению с хозяйской последовательностью. В таком случае репликация вирусного генома и его транскрипция осуществляются по общим клеточным механизмам.
32.Процессы взаимодействия вирусов с чувствительными клетками и факторы, способные их нарушить. Методы культивирования вирусов
Взаимодействие восприимчивых клеток с вирусами человека укладывается в три основных варианта. Первый приводит к гибели (цитолизу) зараженных клеток. Второй, характерный для вирусов цитомегалии, аденовирусов 1-го и 2-го типа отличается развитием сбалансированной, хронической, обычно мало токсичной инфекции персистирующего типа. Третий связан с интеграцией нуклеиновой кислоты вируса с клеточной ДНК или РНК, что характерно для онкогенных вирусов, а возможно, и для вирусных инфекций с хроническим течением.
При первой (цитоцидной) форме, характерной для взаимодействия вирусов гриппа с эпителием дыхательных путей, во внеклеточную жидкость выбрасываются значительные количества жизнеспособных вирионов, быстро инфицирующих новые группы чувствительных клеток. Основную роль в подавлении активности внеклеточного вируса играют вируснейтрализующие антитела и интерферон. Генерализация вируса при персистирующих инфекциях часто осуществляется как путем непосредственного выхода возбудителя во внеклеточные жидкости, так и одновременного продвижения от клетки к клетке через контактирующие клеточные мембраны. Благодаря межклеточному способу распространения такие возбудители, как вирусы герпеса, цитомегалии, легко уходят от воздействия вируснейтрализующих антител.
При интегрированной форме вирусной инфекции, характерной для онкогенных вирусов, вирусная ДНК или РНК интегрирует с ДНК клетки-хозяина по механизму, аналогичному с лизогенией бактериальной клетки. У РНК-содержащих онкогенных вирусов интеграция обеспечивается участием обратной транскриптазы (ревертазы).
Неспецифические и специфические защитные факторы противогриппозного иммунитета направлены не столько на разрушение вирионов в различных секретах и межклеточных жидкостях, как это происходит при антибактериальном иммунитете, сколько на предупреждение опасности репродукции возбудителя в различных группах чувствительных клеток. При участии вируснейтрализующих антител или сходных с ними по механизму действия термолабильных вируснейтрализующих в-ингибиторов успешно блокируются начальные этапы репродукции вирусов гриппа, связанные с прикреплением вируса к оболочке восприимчивой клетки и его внедрением в цитоплазму. В случае внедрения вируса в цитоплазму клетки она быстро реагирует на это нарушение продукцией интерферона, задерживающего репликацию вирусных нуклеиновых кислот. Лихорадочная реакция, сопровождающая заболевания гриппом, способствует усилению продукции интерферона, подавлению синтеза белков и термическому повреждению зрелых вирионов
33.Методы культивирования вирусов
Для культивирования вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы и чувствительных лабораторных животных.
Культуры клеток. Культуры клеток готовят из тканей животных или человека. Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые.
Приготовление первичной культуры клеток складывается из нескольких последовательных этапов: измельчения ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде Перевиваемые однослойные культуры клеток приготовляют из злокачественных и нормальных линий клеток, обладающих способностью длительно размножаться invitro в определенных условиях. К ним относятся злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки амниона человека, почек обезьяны и др.К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клетки человека. Они представляют собой клеточную систему, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток используемой ткани. Диплоидные клетки человека не претерпевают злокачественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых.
Куриные эмбрионы. Куриные эмбрионы по сравнению с культурами клеток значительно реже бывают контаминированы вирусами и микоплазмами, а также обладают сравнительно высокой жизнеспособностью и устойчивостью к различным воздействиям.
К недостаткам данного метода относятся невозможность обнаружения исследуемого микроорганизма без предварительного вскрытия эмбриона, а также наличие в нем большого количества белков и других соединений, затрудняющих последующую очистку риккетсий или вирусов при изготовлении различных препаратов.
Лабораторные животные. Видовая чувствительность животных к определенному вирусу и их возраст определяют репродуктивную способность вирусов. Во многих случаях только новорожденные животные чувствительны к тому или иному вирусу (например, мыши-сосунки -- к вирусам Коксаки).
Преимущество данного метода перед другими состоит в возможности выделения тех вирусов, которые плохо репродуцируются в культуре или эмбрионе. К его недостаткам относятся контаминация организма подопытных животных посторонними вирусами и микоплазмами, а также необходимость последующего заражения культуры клеток для получения чистой линии данного вируса, что удлиняет сроки исследования.
34.Экология микроорганизмов. Круговорот веществ в природе и участие в нем микробов. Микрофлора внешней среды (почвы, воды, воздуха)
Экология микроорганизмов изучает их взаимоотношения друг с другом и с окружающей средой.
Микрофлора почвы
Микрофлора почвы характеризуется большим разнообразием микроорганизмов, которые принимают участие в процессах почвообразования и самоочищения почвы, кругооборота в природе азота, углерода и других элементов. В почве обитают бактерии, грибы, лишайники (симбиоз грибов с цианобактериями) и простейшие. На поверхности почвы микроорганизмов относительно мало, так как на них губительно действуют УФ-лучи, высушивание и т. д.Наибольшее число микроорганизмов содержится в верхнем слое почвы толщиной до 10 см. По мере углубления в почву количество микроорганизмов уменьшается и на глубине 3--4 м они практически отсутствуют.Состав микрофлоры почвы меняется в зависимости от типа и состояния почвы, состава растительности, температуры, влажности и т.д. Большинство микроорганизмов почвы способны развиваться при нейтральном рН, высокой относительной влажности, при температуре от 25 до 45 °С. В почве живут бактерии, способные усваивать молекулярный азот (азотфиксирующие), относящиеся к родам Azotobacter, Azomonas, Mycobacterium и др. Азотфиксирующие разновидности цианобактерий, или сине-зеленых водорослей, применяют для повышения плодородия рисовых полей. Такие бактерии, как псевдомонады, активно участвуют в минерализации органических веществ, а также восстановлении нитратов до молекулярного азота. Кишечные бактерии (сем.Enterobacteriaceae) -- кишечная палочка, возбудители брюшного тифа, сальмонеллезов, дизентерии -- могут попадать в почву с фекалиями. Однако в почве отсутствуют условия для их размножения, и они постепенно отмирают. В чистых почвах кишечная палочка и протей встречаются редко; обнаружение их в значительных количествах является показателем загрязнения почвы фекалиями человека и животных и свидетельствует о ее санитарно-эпидемиологическом неблагополучии (возможность передачи возбудителей инфекционных заболеваний).