Материал: Лебухов ФХ методы исслдния292-325
Глава 6. Методы хроматографического анализа |
307 |
6.3. ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Тонкослойная хроматография (ТСХ) является одним из наиболее простых и эффективных экспресс методов разделения и анализа веществ в пищевых продуктах, био логических жидкостях и других объектах, не требующих сложного оборудования. В то же время метод обладает высокой избирательностью и чувствительностью (низким пределом обнаружения). Этим методом можно определить 10–20 мкг вещества с точностью до 5–7%.
В зависимости от природы НФ тонкослойная хрома тография может быть адсорбционной и распределитель ной. Наиболее широко применяется первый вариант раз деления.
Неподвижная твердая фаза (оксид алюминия, сили кагель и др.) тонким слоем наносится на стеклянную, металлическую (алюминиевая фольга) или пластмассовую пластинку и закрепляется с помощью крахмала или гип са (иногда используют пластинки с незакрепленным сло ем). Для хроматографирования подходят готовые плас тинки, выпускаемые промышленностью размером 5 15 и 20 20 см.
На расстоянии 2 см от края пластинки на стартовую линию с помощью микропипетки или микрошприца на носят пробы анализируемого раствора (диаметр пятен 3– 5 мм). После испарения растворителя край пластинки помещают в стеклянную камеру, на дно которой налит ра створитель (ПФ) в количестве, достаточном для образова ния слоя глубиной 0,5 см. Камеру закрывают крышкой.
Выбор растворителя (ПФ) зависит от природы сорбен та и свойств анализируемых соединений. Например, раз деление хлорорганических пестицидов на пластинке с си ликагелем производят в среде гексана. Часто применяют смеси растворителей из двух или трех компонентов. Так, при хроматографировании аминокислот используют смесь Н бутанола с уксусной кислотой и водой, при анализе не органических ионов — водные буферные растворы, созда ющие постоянное значение рН.
308 ЧАСТЬ I. ТЕОРИЯ: ФИЗИКО ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
При хроматографировании растворитель движется сни зу вверх (восходящий вариант) вдоль слоя сорбента и с разной скоростью переносит компоненты смеси, что при водит к их пространственному разделению. По окончании хроматографического процесса пластинку вынимают из камеры, отмечают линию фронта растворителя (обычно10 см) и высушивают.
Если компоненты смеси окрашены, то после разделе ния они четко видны на пластине. Неокрашенные соеди нения обнаруживают различными способами. Если плас тину поместить в камеру с парами йода, то четко прояв ляются коричневые пятна для органических соединений с непредельными связями.
Хроматограмму можно проявить, опрыскивая ее ка ким либо реагентом, дающим с компонентами пробы ок рашенные соединения. В состав нанесенного слоя готовых пластин часто вводят люминофор. При облучении такой пластины ультрафиолетовыми лучами она флуоресциру ет, а разделенные компоненты пробы проявляются в виде темных пятен. Вещества, имеющие собственную флуорес ценцию (например пестициды), также обнаруживают с помощью УФ излучения.
Вещества на хроматограмме идентифицируют: по ха рактеру окраски пятен, параметру удерживания Rf и с по мощью стандартных веществ (свидетелей).
Величина Rf рассчитывает ся из экспериментальных дан ных по уравнению
Рис. 6.3
Хроматограмма двухкомпонентной смеси
R 1 |
l |
, |
(6.5) |
f L
где l — расстояние от старто вой линии до центра пятна; L — расстояние, пройденное за это же время растворителем (рис. 6.3).
При стандартных условиях Rf является постоянной вели чиной, характерной для дан
Глава 6. Методы хроматографического анализа |
309 |
Рис. 6.4
Хроматограмма жира:
I — полимеризованные и сильнополярные жиры; II — фосфолипиды; III — триглицериды; 1 — говяжье мясо; 2 — свинина; 3 — свинина с 20% печени; 4 — свинина с 40% печени; 5 — свинина с 50% печени; 6 — свиная печень.
ного соединения. Но практика показывает, насколько труд но создать постоянство всех факторов, от которых зави сит воспроизводимость значений Rf. На величину Rf влия ет качество и активность сорбента, его влажность, толщи на слоя, качество растворителей и другие факторы, не всегда поддающиеся достаточному контролю. Поэтому наряду с величиной Rf идентификацию проводят по «сви детелю». Стандартное вещество (свидетель), наличие ко торого предполагается в анализируемой смеси, наносят на линию старта рядом с исследуемой пробой. Таким обра зом, нанесенное стандартное вещество хроматографиру ется в тех же условиях.
После хроматографирования и детекции пятен срав нивают величины Rf определяемого вещества и «свиде теля».
Качественный анализ после разделения компонентов смеси методом ТСХ часто используют для определения состава пищевых продуктов. Так, на рисунке 6.4 представ лена хроматограмма жира, выделенного из мясного фар ша различного состава. Хроматографирование проводи ли на пластинках с силикагелем в системе гексан — ди этиловый эфир (в соотношении 3:1), пятна детектировали 10% раствором фосфорно молибденовой кислоты, иден тифицировали по голубому цвету зон на желтом фоне пла стинки. Как видно из хроматограммы, при данных усло виях произошло разделение фосфолипидов и триглицери дов. По характерному составу компонентов мяса и печени
310 ЧАСТЬ I. ТЕОРИЯ: ФИЗИКО ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
можно сделать вывод о натуральности мясного фарша в пробах 1–2 и добавках к нему печени в пробах 3–5.
Количественное определение в ТСХ можно сделать не посредственно на пластинке или после удаления веществ с нее. При определении на пластинке измеряют площадь пятна тем или иным способом (например, с помощью миллиметровой кальки) и по заранее построенному гра дуировочному графику находят количество вещества. За висимость между массой вещества q и площадью S на хро матограммах носит нелинейный характер и является ло гарифмической:
S = algq + в, |
(6.6) |
где а и в — эмпирические константы. Эта зависимость ли нейна для количеств вещества от 1 до 80–100 мкг.
Для построения градуировочного графика на пластин ку наносят растворы, содержащие разные количества стан дартного вещества, хроматографируют, проявляют зоны и измеряют их площади (рис. 6.5).
Более точен денситометрический метод определения веществ на хроматограммах (ошибка 1–2%). При денси тометрии производят измерение оптического поглощения проявленной хроматограммы сканирующим лучом в про ходящем или отраженном свете на специальных прибо рах — денситометрах (рис. 6.6).
На денситограмме получают пики, площадь которых пропорциональна содержанию вещества в пятне. Постро ив с помощью стандартов калибровочный график, изме ряют площадь пика компонента и по графику определяют его массу в пробе.
Все чаще используется также спектрофотоденсито, метрическое и флуориметрическое определение веществ на хроматограммах. В первом случае используют специ альные спектрофотоденситометры, измеряющие поглоще ние вещества в монохроматическом свете, во втором из меряют флуоресценцию пятна при облучении хроматог раммы УФ лучами. Широкое распространение получил способ экстрагирования компонентов из зон подходящим растворителем. При применении этого способа на хрома
Глава 6. Методы хроматографического анализа |
311 |
Рис. 6.5
Зависимость площади пятен на хроматограмме от количества вещества:
а — хроматограмма; б — калибровочный график.
Рис. 6.6
Схема денситометра:
1 — протяжный механизм; 2 — источник света; 3 — хрома тограмма; 4 — фотоэлектрический преобразователь; 5 — уси литель; 6 — самописец.
тограмму наносят стандартный раствор и раствор пробы. Получив хроматограмму, ее обрабатывают, детектируя зону стандарта, вырезают часть хроматограммы с зоной компонента пробы и производят его экстрагирование под ходящим растворителем. Полученный раствор анализи руют инструментальным методом с высокой чувствитель ностью. Чаще всего применяют спектрофотометрические и фотоколориметрические методы. Если вещество не име ет цвета или не обладает поглощением в УФ области из лучения, то экстракт подвергают фотометрической реак ции, что позволяет получить интенсивно поглощающее производное вещества.