Материал: Лебухов ФХ методы исслдния292-325

ся в анион NH2...СОО– и движется к аноду. В изоэлектри ческой точке аминокислота находится в растворе в виде биполярного иона NH3+...СОО– и в электрическом поле не передвигается.

Ввиду того, что отдельные белки и аминокислоты име ют различные изоэлектрические точки, при определенном значении рН они передвигаются с разной скоростью. Под бирая буферные растворы для установления определенной скорости движения и растворимости веществ, можно ис пользовать электрофорез для их разделения. Метод позво ляет разделять вещества, различие которых в изоэлект рической точке составляет до 0,02 единиц рН. Градиент рН в 0,02 единицы часто достигают прибавлением амфо литов, представляющих собой готовую смесь алифатичес ких полиаминополикарбоновых кислот.

Электрофоретическое разделение белков широко ис пользуется для оценки качества мяса и мясных продук тов, для дифференцирования видов мяса и рыбы. Метод также применяется для выявления немясных добавок (белков молока, сои, яиц) в мясных продуктах. С помо щью электрофореза в полиакриламидном геле можно оха рактеризовать изменение белков в процессе созревания сыров: электрофорез в агарозном геле, окрашенном бро мистым этилом, используют для детекции генетически модифицированных ингредиентов в пищевых продуктах (рис. 6.10).

В настоящее время используют высокоэффективный капиллярный электрофорез — метод разделения и ана лиза компонентов сложных смесей. При анализе этим ме тодом пробу небольшого объема вводят в кварцевый ка пилляр, заполненный электролитом. К капилляру при кладывают напряжение от 10 до 30 кВ. Под действием электрического поля компоненты пробы начинают дви гаться по капилляру с разной скоростью, зависящей от их структуры, заряда и молекулярной массы, и, соответствен но, в разное время достигают детектора (фотометрического или спектрофлуориметрического). Полученная электро фореграмма представляет собой последовательность пи ков, по которым, как и в хроматограмме, можно иденти

318 ЧАСТЬ I. ТЕОРИЯ: ФИЗИКО ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

фицировать и количественно определять конкретное со единение.

Метод обеспечивает очень высокую эффективность раз деления, поэтому широко употребляется не только для вы явления близких по строению веществ (белков, пептидов, аминокислот, витаминов, наркотиков, красителей, ионов металлов, анионов), но и для контроля качества, техноло гического контроля и идентификации лекарственных пре паратов и пищевых продуктов. Капиллярный электрофо рез используют для анализа витаминов А, Е, K, D, B1, B2, B6, B12, С, никотинамида в диетических продуктах, опре деления сульфат , хлорид , йодид ионов в молочных про дуктах.

6.6.

ГЕЛЬПРОНИКАЮЩАЯ (МОЛЕКУЛЯРНО СИТОВАЯ) ХРОМАТОГРАФИЯ

Гельпроникающая хроматография (ГПХ) представля ет собой метод разделения молекул, основанный на раз личии их размеров.

Неподвижной фазой в ГПХ является растворитель, находящийся в порах геля, а подвижной — сам раство ритель, т. е. и подвижную и неподвижную фазу представ ляет одно и то же вещество или смесь веществ. Гель на полимерной основе (декстран, полиакриламид, иные при родные и синтетические полимеры). Различают мягкие, полужесткие и жесткие гели. Принцип разделения моле кул в ГПХ состоит в том, что молекулы анализируемых веществ распределены между неподвижным растворите лем в порах сорбента и растворителем, протекающим че рез слой неподвижной фазы. Молекулы, которые имеют размеры, позволяющие им проникать в поры сорбента при движении вдоль колонки, часть времени теряют на пре бывание в порах. Молекулы, превосходящие поры по раз мерам, не проникают в сорбент и вымываются из колонки со скоростью движения элюента. Молекулы, которые про никают в поры всех размеров, движутся наиболее медлен

но. Снижение скорости движения веществ вдоль колонки тем больше, чем в большее число пор способны диффун дировать распределяемые частицы.

Таким образом, при помощи ГПХ можно разделить смеси веществ в зависимости от размеров их молекул. Выход веществ из колонки происходит в порядке умень шения их молекулярной массы. Так можно разделить по липептиды, белки и другие макромолекулы.

Гельпроникающая хроматография на колонке исполь зуется для очистки пестицидов, а также жирораствори мых витаминов перед их определением методом ВЖХ.

6.7.

ГАЗОВАЯ И ГАЗОЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

В газовой хроматографии (ГХ) в качестве подвижной фазы используют газ (азот, гелий, водород), называемый газом носителем. Пробу подают в виде паров. Неподвиж ной фазой служит либо твердое вещество — сорбент (га зоадсорбционная хроматография), либо высококипящая жидкость, нанесенная тонким слоем на твердый носитель (газожидкостная хроматография). Рассмотрим вариант газожидкостной хроматографии (ГЖХ). В качестве носи теля применяют кизельгур (диатомит) — разновидность гидратированного силикагеля; его часто обрабатывают реагентами, которые переводят группы Si–OH в группы Si–O–Si(CH3)3, что повышает инертность носителей по от ношению к растворителям. Таковыми являются, напри мер, носители «хромосорб W» и «газохром Q». Кроме того, используют стеклянные микрошарики, тефлон и другие материалы.

Неподвижную жидкую фазу наносят на твердый носи тель. Эффективность разделения в газожидкостной хро матографии зависит главным образом от правильности выбора жидкой фазы. При этом полезным оказалось ста рое правило: подобное растворяется в подобном. В соот ветствии с этим правилом для разделения смеси двух ве ществ выбирают жидкую фазу, близкую по химической

ко химических свойств газового потока, выходящего из колонки, по сравнению с чистым газом носителем. Суще ствует множество детекторов, однако широкое примене ние находят только высокочувствительные и универсаль ные. К таковым относятся: катарометр (детектор тепло проводности); пламенно ионизационный детектор (ПИД), в котором водородное пламя служит источником иониза ции органического соединения; детектор электронного захвата (ЭЗД); термоионный детектор (ТИД), обладающий высокой селективностью к органическим веществам, со держащим фосфор, азот и серу. Интерес к этому детекто ру заметно возрос в связи с заменой хлорсодержащих пе стицидов фосфорсодержащими ядохимикатами, которые используются в сельском хозяйстве и попадают в пищевые продукты. Катарометр позволяет определить концентра ции веществ в пределах 0,1–0,01%, ПИД — 10–3–10–5%; ЭЗД — 10–6–10–10%. Современные детекторы определяют даже пикограммы (10–12 г) вещества в пробе.

Качественный и количественный анализ в методе ГХ производят так же, как и в ВЖХ.

Газожидкостная хроматография находит широкое применение для разделения, идентификации и количе ственного определения сложных многокомпонентных си стем, таких как нефть, биологические жидкости, пище вые продукты, парфюмерно косметические изделия и мно гие другие. Метод отличается высокой чувствительностью, экспрессностью; для анализа не требуется большого ко личества исследуемого образца.

Среди разнообразных хроматографических методов газовая и высокоэффективная жидкостная хроматография являются самыми перспективными для решения сложных задач, связанных с качеством пищевых продуктов. Так, с применением этих методов возможны:

определение химической природы веществ, обуслов ливающих характерный аромат свежих продуктов;

контроль состояния продуктов в процессе обработки и хранения;

объективная оценка показателей, характеризующих качество исходного сырья и готовых изделий;