Материал: Лебухов ФХ методы исслдния292-325

зерна адсорбента должны быть одинаковой степени дисперсности.

При выборе условий для хроматографического процес са учитывают свойства адсорбента и адсорбируемых ве ществ.

В классическом варианте жидкостной колоночной хроматографии (ЖКХ) через хроматографическую ко лонку, представляющую собой стеклянную трубку диа метром 0,5–5 см и длиной 20–100 см, заполненную сор бентом (НФ), пропускают элюент (ПФ). Под воздействи ем силы тяжести элюент движется; его скорость можно регулировать имеющимся в низу колонки краном. Ана лизируемую смесь помещают в верхнюю часть колонки. По мере продвижения пробы по колонке происходит раз деление компонентов. Через определенные промежутки времени отбирают фракции выделившегося из колонки элюента, который анализируют каким либо методом, по зволяющим измерять концентрации определяемых ве ществ.

Колоночная адсорбционная хроматография в настоя щее время применяется главным образом не как самосто ятельный метод анализа, а как способ предварительного (а иногда и конечного) разделения сложных смесей на бо лее простые, т. е. для подготовки к анализу другими ме тодами (в том числе и хроматографическими). Например, на колонке с окисью алюминия разделяют смесь токофе ролов, пропускают элюент и собирают фракцию а токо ферола для последующего определения фотометрическим методом.

ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Вследствие медленного продвижения ПФ хроматогра фическое разделение смеси на колонке занимает много времени. Этого недостатка лишена высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЖХ). Для ускорения про цесса хроматографирование проводят под давлением.

Модернизация аппаратуры, применяемой в классичес кой жидкостной колоночной хроматографии, сделала этот

298 ЧАСТЬ I. ТЕОРИЯ: ФИЗИКО ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

метод анализа одним из наиболее перспективных и со временных. ВЖХ является удобным способом разделе ния, препаративного выделения и проведения качествен ного и количественного анализа нелетучих термолабиль ных соединений как с малой, так с большой молекулярной массой.

В зависимости от типа применяемого сорбента в дан ном методе используют два варианта хроматографирова ния: на полярном сорбенте с использованием неполярного элюента (вариант прямой фазы) и на неполярном сорбенте с использованием полярного элюента — так называемая обращенно фазовая высокоэффективная жидкостная хро матография (ОфВЖХ).

При переходе элюента к элюенту равновесие в услови ях ОфВЖХ устанавливается во много раз быстрее, чем в условиях полярных сорбентов и неводных ПФ. Благодаря этому факту, а также удобству работы с водными и водно спиртовыми элюентами ОфВЖХ получила широкое рас пространение. Большинство анализов при помощи ВЖХ проводят именно этим методом.

Аппаратура для ВЖХ. Комплект современного обору дования для ВЖХ (рис. 6.1), как правило, состоит из двух насосов 3, 4, управляемых микропроцессором 5 и подаю щих элюент по определенной программе. Насосы создают давление до 40 МПа. Проба вводится через специальное устройство (инжектор или дозатор) 7 непосредственно в поток элюента. После прохождения через хроматографи

Рис. 6.1

Схема современного жидкостного хроматографа:

1, 2 — сосуды с элюентами; 3, 4 — насосы; 5 — контроллер; 6 — смесительная камера; 7 — инжектор; 8 — колонка; 9 — детектор; 10 — регистратор; 11 — блок автоматической обработки результатов анализа; 12 — коллектор фракций; 13 — термостат.

ческую колонку 8 вещества детектируются высокочув ствительным проточным детектором 9, сигнал которого регистрируется и обрабатывается микро ЭВМ 11. При не обходимости в момент выхода пика автоматически отби раются фракции.

Колонки для ВЖХ выполняют из нержавеющей стали с внутренним диаметром 2–6 мм и длиной 10–25 см. Ко лонки заполняют сорбентом (НФ). В качестве НФ исполь зуются силикагель, оксид алюминия или модифициро ванные сорбенты. Модифицируют обычно силикагель, внедряя химическим путем в его поверхность различные функциональные группы.

Детекторы. Выход компонента из колонки регист рируется с помощью детектора. Для регистрации можно использовать изменение любого аналитического сигнала, идущего от ПФ и связанного с природой и количеством компонента. В жидкостной хроматографии используют такие аналитические сигналы, как светопоглощение в УФ области или светоиспускание выходящего раствора (спек трофотометрические и флуориметрические детекторы), показатель преломления (рефрактометрические детекто ры), потенциал и электрическая проводимость (электро химические детекторы) и др.

Непрерывно детектируемый сигнал преобразуется, усиливается и регистрируется самописцем. Хроматограм ма представляет собой зафиксированную на ленте само писца последовательность сигналов детектора, вырабаты ваемых при выходе из колонки отдельных компонентов. В случае разделения смеси на внешней хроматограмме видны отдельные пики.

Положение пика на хроматограмме используют для идентификации вещества, высоту или площадь пика — для количественного определения.

Качественный анализ. Важнейшие характеристики хроматограммы — время удерживания tR и связанный с ним удерживаемый объем — отражают природу веществ, их способность к сорбции на материале неподвижной фазы и, следовательно, при постоянстве условий хроматогра фирования являются средством идентификации вещества.

300 ЧАСТЬ I. ТЕОРИЯ: ФИЗИКО ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Рис. 6.2

Параметры хроматограммы

Для данной колонки с определенными скоростью потока и температурой время удерживания каждого соединения постоянно. На рисунке 6.2 tR(A) — время удерживания ком понента А анализируемой смеси с момента ввода в колон ку до появления на выходе из колонки максимума пика, tR(BC) — время удерживания внутреннего стандарта (пер воначально отсутствующее в анализируемой смеси веще ство); h — высота пика (мм), а1/2 — ширина пика (мм) на половине его высоты.

Для идентификации вещества по хроматограмме обыч но используют стандартные образцы или чистые вещества: сравнивают время удерживания неизвестного компонен та tRx с временем удерживания tRCT известных веществ. Но более надежна идентификация по относительному вре мени удерживания:

Сначала вводят в колонку известное вещество (внутрен ний стандарт) и измеряют время его удерживания tR(BC), затем хроматографируют исследуемую смесь, в которую предварительно добавляют внутренний стандарт. Относи тельное время удерживания определяют по формуле (6.1).

Количественный анализ. В основе этого анализа лежит зависимость высоты пика h или его площади S от количе ства вещества. Для узких пиков предпочтительнее изме рение h, для широких размытых — S. Площадь пика из меряют разными способами: умножением высоты пика (h)

на ширину (а1/2), измеренную на половине его высоты (рис. 6.2); планиметрированием; с помощью интегратора. Современные хроматографы оснащены электрическими или электронными интеграторами.

Для определения содержания веществ в пробе исполь зуют в основном три метода: абсолютной градуировки, внутренней нормализации и внутреннего стандарта.

Метод абсолютной градуировки основан на предва рительном определении зависимости между количеством введенного вещества и площадью или высотой пика на хроматограмме. В хроматограмму вводят известное коли чество градуировочной смеси, определяют площадь или высоту полученных пиков и строят график зависимости площади или высоты пика от количества введенного ве щества. Анализируют исследуемый образец, измеряют площадь или высоту пика определяемого компонента и на основании градуировочного графика рассчитывают его количество.

Метод внутренней нормализации основан на приве дении к 100% суммы площадей всех пиков на хромато грамме.

Массовую долю в % одного компонента рассчитывают по формуле

где K — поправочные коэффициенты; SА, SВ, Si — площа ди пиков компонентов смеси.

Этот метод дает информацию только об относительном содержании компонента в смеси, но не позволяет опреде лить его абсолютную величину.

Метод внутреннего стандарта основан на сравнении выбранного параметра пика анализируемого вещества с тем же параметром стандартного вещества, введенного в

пробу. В исследуемую пробу вводят известное количество такого стандартного вещества, пик которого достаточно хорошо отделяется от пиков компонентов исследуемой смеси (рис. 6.2). Проводят анализ пробы с внутренним