Материал: Курс занятий. Белки

Желудочные протеиназы: пепсин, гастриксин, их роль в переваривании белков.

Их роль в том, чтобы разделить один БОЛЬШОЙ белок на более короткие полипетиды и олигопептиды

Методы количественного определения пепсина.

Метод определения по Пятницкому

Пепсин, протеолитический фермент, способен гидролизировать белки при рН 1,5-2,5, а при рН 5,0 – створаживать казеиноген молока за счет превращения его в казеин (в основе превращения лежит также гидролиз пептидных связей). За единицу активности фермента принимают такое его количество, которое створаживает 5 мл молочно-ацетатной смеси рН 5,0 (смесь равных объемов молока и 1н. ацетатного буфера рН 5,0) при 25°С за 60 секунд. 100 единиц Пятницкого соответствует 1 мг фермента. В норме желудочный сок содержит 20-40 ед/мл (0,2-0,4 мг/мл, или 0,2-0,4 г/л) пепсина.

ПАТОЛОГИЧЕСКИЕ СОСТАВНЫЕ ЧАСТИ ЖЕЛУДОЧНОГО СОКА. ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

НАРУШЕНИЕ ПЕРЕВАРИВАНИЯ И ВСАСЫВАНИЯ БЕЛКОВ.

При различных заболеваниях ЖКТ в желудке нарушается выделение НСl и пепсиногена, при этом заметно снижается переваривание белков. Наиболее часто встречаются патологические изменения кислотности желудочного сока.

Повышенная кислотность (норма 40-60ТЕ) желудочного сока сопровождается изжогой, диареей и может быть симптомом язвы желудка и двенадцатиперстной кишки, гиперацидного гастрита.

Пониженная кислотность бывает при некоторых видах гастритов. Полное отсутствие НСl и пепсина (ахилия) наблюдается при атрофических гастритах.

Анацидность (рН >6) часто вызывает рак желудка.

У некоторых людей возникает иммунная реакция на прием белка, что связано со способностью к всасыванию негидролизованных коротких пептидов. Аминокислоты лишены антигенных свойств и иммунных реакций не вызывают.

У новорожденных проницаемость слизистой оболочки кишечника выше, чем у взрослых, поэтому в кровь могут поступать антитела молозива. Это усугубляется наличием в молозиве белка-ингибитора трипсина. Протеолитические ферменты в пищеварительных секретах новорожденных обладают низкой активностью. Это способствует всасыванию в кишечнике небольшого количества нативных белков, достаточного для обеспечения иммунной реакции. Подобное усиление всасывающей способности кишечника является причиной непереносимости белков пищи (молока, яиц) у взрослых людей.

При заболевании целиакии (нетропической спру) происходит нарушение клеток слизистой оболочки кишечника, где всасываются небольшие негидролизованные пептиды. Целиакия характеризуется повышенной чувствительностью к глютену (белок клейковины зерен злаков), который оказывает токсическое действие на слизистую тонкой кишки, что приводит к ее патологическим изменениям и нарушению всасывания.

Диагностическое значение: Общая кислотность желудочного сока может как повышаться (гипера-цидное состояние), так и снижаться (гипоацидное), вплоть до исчезнове-ния (анацидное состояние). Гиперацидное состояние вызывается в основ-ном избытком свободной соляной кислоты, т.е. возникает гиперхлоргид-рия. Снижение HCI в желудочном соке — это гипохлоргидрия, отсутствие – ахлоргидрия. Изменение кислотности желудочного сока имеет место при язвенной болезни, гастритах, при раке, злокачественном малокровии.

Химический состав панкреатического и кишечного соков. Роль панкреатических и кишечных протеиназ в переваривании белков.

Дуоденальный сок - пищеварительный сок двенадцатиперстной кишки, состоящий из секрета поджелудочной железы, желчи, сока кишечных крипт и дуоденальных желез

Панкреатический сок имеет высокую концентрацию бикарбонатов, которые обусловливают его щелочную реакцию. Его рН колеблется от 7,5 до 8,8. В соке содержатся хлориды натрия, калия и кальция, сульфаты и фосфаты. Вода и электролиты выделяются в основном центроацинарными и эпителиальными клетками выводах протоков. В состав сока входит и слизь, которая вырабатывается бокаловидными клетками главного протока поджелудочной железы. Панкреатический сок богат ферментами, осуществляющими гидролиз белков, жиров и углеводов. Они вырабатываются ацинарными панкреацитами.

Протеолитические ферменты (трипсин, химотрипсин, эластаза, карбок-сипептидазы А и В) выделяются панкреацитами в неактивном состоянии, что предотвращает самопереваривание клеток.

Трипсин. Трипсиноген и трипсин получены в кристаллическом виде, полностью расшифрована их первичная структура и известен молекулярный механизм превращения профермента в активный фермент. В опытах in vitro превращение трипсиногена в трипсинкатализируют не только энтеропептидаза и сам трипсин, но и другие протеиназы и ионы Са^2+.

Активирование трипсиногена химически выражается в отщеплении с N-конца полипептидной цепи 6 аминокислотных остатков (Вал–Асп– Асп–Асп–Асп–Лиз) и соответственно в укорочении полипептидной цепи.

Следует подчеркнуть, что в этом небольшом, казалось бы, химическом процессе – отщепление гексапептида от предшественника – заключено важное биологическое значение, поскольку при этом происходят формирование активного центра и образование трехмерной структуры трипсина, а известно, что и белки биологически активны только в своей нативной трехмерной конформации. В том, что трипсин, как и другие протеиназы, вырабатывается в поджелудочной железе в неактивной форме, также имеется определенный физиологический смысл, поскольку в противном случае трипсин мог бы оказывать разрушающее протеолитическое действие не только на клетки самой железы, но и на другие ферменты, синтезируемые в ней (амилаза, липаза и др.). В то же время поджелудочная железа защищает себя еще одним механизмом – синтезом специфического белка ингибитора панкреатическоготрипсина. Этот ингибитор оказался низкомолекулярным пептидом (мол. масса 6000), который прочно связывается с активными центрами трипсина и химотрипсина, вызывая обратимое их ингибирование. В поджелудочной железе синтезируется также α1-антипротеиназа (мол. масса 50000), которая преимущественно инги-бирует эластазу.

При остром панкреатите, когда трипсин и другие ферменты из пораженной поджелудочной железы «вымываются» в кровь, уровень их вкрови соответствует размерам некротического участка. В этом случае определение активности трипсина в сыворотке крови является надежным ферментным тестом при диагностике острого панкреатита. Следует отметить, что субстратная специфичность трипсинаограничена разрывом только тех пептидных связей, в образовании которых участвуют карбоксильные группы лизина и аргинина.

Химотрипсин. В поджелудочной железе синтезируется ряд химотрип-синов (α-, β- и π-химотрипсины) из двух предшественников – химотрипсиногена А и химотрипсиногена В. Активируются проферменты в кишечнике под действием активного трипсина ихимотрипсина. Полностью раскрыта последовательность аминокислот химотрипсиногена А, во многом сходная с последовательностьюаминокислот трипсина. Молекулярная масса его составляет примерно 25000. Он состоит из одной полипептидной цепи, содержащей 246 аминокислотных остатков. Активация профермента не сопряжена с отщеплением большого участка молекулы. Получены доказательства, что разрыв одной пептидной связи между аргинином и изолейцином в молекуле химотрипсиногена А под действием трипсина приводит к формированию π-химотрипсина, обладающего наибольшей ферментативной активностью. Последующее отщепление дипеп-тида Сер–Арг приводит к образованию δ-химотрипсина. Аутокаталити-ческий процесс активирования, вызванный химотрипсином, сначала способствует формированию неактивного промежуточного неохимотрипсина, который под действием активного трипсина превращается в α-химотрип-син; этот же продукт образуется из δ-химотрипсина, но под действием активного химотрипсина. Таким образом, благодаря совместному перекрестному воздействию химотрипсина и трипсина из химотрипсиногена образуются разные химо-трипсины, различающиеся как ферментативной активностью, так и некоторыми физико-химическими свойствами, в частности электрофорети-ческой подвижностью. Следует отметить, что химотрипсин обладает более широкой субстратной специфичностью, чем трипсин. Он катализирует гидролиз не только пептидов, но и эфиров, гидроксаматов, амидов и других ацилпроизводных, хотя наибольшую активность химотрипсин проявляет по отношению к пептидным связям, в образовании которых принимают участие карбоксильные группы ароматических аминокислот:фенилаланина, тирозина и триптофана.

Эластаза. В поджелудочной железе синтезируется еще одна эндопеп-тидаза – эластаза – в виде проэластазы. Превращениепрофермента в эластазу в тонкой кишке катализируется трипсином. Название фермент получил от субстрата эластина, который он гидролизует. Эластин содержится в соединительной ткани и характеризуется наличием большого числа остатков глицина и серина. Эластаза обладает широкой субстратной специфичностью, но предпочтительнее гидролизует пептидные связи, образованныеаминокислотами с небольшими гидрофобными радикалами, в частности глицином, аланином и серином. Интересно, что ни трипсин, нихимотрипсин не гидролизуют пептидные связи молекулы эластина, хотя все три фермента, включая эластазу, содержат сходные участкиаминокислотных последовательностей и одинаковые места положения дисульфидных мостиков, а также имеют в активном центре один и тот же ключевой остаток серина, что подтверждают опыты с ингибированием всех трех ферментовдиизопропилфторфосфатом, химически связывающим ОН-группу серина. Высказано предположение, что все три эндопептидазы поджелудочной железы: трипсин, химотрипсин и эластаза,– возможно, имеют один и тот же общий предшественник и чтоспецифичность активного фермента в основном определяется конформационными изменениями профермента в процессе активирования.

Экзопептидазы. В переваривании белков в тонкой кишке активное участие принимает семейство экзопептидаз. Одни из них – карбоксипеп-тидазы – синтезируются в поджелудочной железе в виде прокарбоксипеп-тидазы и активируются трипсином в кишечнике; другие – аминопептидазы – секретируются в клетках слизистой оболочки кишечника и также активируются трипсином.

Карбоксипептидазы. Подробно изучены две карбоксипептидазы – А и В, относящиеся к металлопротеинам и катализирующие отщепление от полипептида С-концевых аминокислот. Карбоксипептидаза А разрывает преимущественно пептидные связи, образованные концевыми ароматическими аминокислотами, а карбоксипептидаза В – связи, в образовании которых участвуют С-концевые лизин и аргинин. Очищенный препарат карбокси-пептидазы А обладает бифункциональной активностью – пептидазной и эстеразной и содержит ион Zn²⁺(один атом на 1 моль фермента). При замене ионов Zn²⁺на ионы Са²⁺ полностью утрачивается пепти-дазная активность, но усиливается исходная эстеразная активность, хотя

при этом существенных изменений в третичной структуре фермента не отмечается.

Аминопептидазы. В кишечном соке открыты два фермента – аланин-аминопептидаза, катализирующая преимущественно гидролизпептидной связи, в образовании которой участвует N-концевой аланин, и лейцин-аминопептидаза, не обладающая строгой субстратнойспецифичностью и гидролизующая пептидные связи, образованные любой N-концевой аминокислотой. Оба фермента осуществляют ступенчатое отщепление аминокислот от N-конца полипептидной цепи.

Дипептидазы. Процесс переваривания пептидов, их расщепление до свободных аминокислот в тонкой кишке завершают дипептидазы. Среди дипептидаз кишечного сока хорошо изучена глицилглицин-дипептидаза, гидролизующая соответствующий дипептид до двухмолекул глицина. Известны также две другие дипептидазы: пролил-дипептидаза (пролиназа), катализирующая гидролиз пептидной связи, в образовании которой участвует СООН-группа пролина, и пролин-дипептидаза (пролидаза), гидроли-зующая дипептиды, в которых азот пролина связан кислотно-амидной связью.

Б иохимические механизмы регуляции пищеварения, гормоны желудочно-кишечного тракта. Всасывание аминокислот.

Конечными продуктами гидролитического расщепления белков являются свободные аминокислоты, подвергающиеся активному транспорту через мембрану энтероцита в кровь.

Аминокислоты, образовавшиеся при переваривании белков, быстро всасываются в кишечнике. Транспорт их осуществляется двумя путями: через воротную систему печени, ведущую прямо в печень, и по лимфатическим сосудам, сообщающимся с кровью через грудной лимфатический проток. Максимальная концентрация аминокислот в крови достигается через 30- 50 мин после приёма белковой пищи (углеводы и жиры замедляют всасывание аминокислот). Всасывание L-аминокислот (но не D-изомеров) - активный процесс, требующий затраты энергии. Аминокислоты переносятся через кишечную стенку от слизистой её поверхности в кровь. Перенос через щёточную кайму осуществляется целым рядом переносчиков, многие из которых действуют при участии Na+-зависимых механизмов симпорта, подобно переносу глюкозы.

В настоящее время известно по крайней мере пять специфических транспортных систем, каждая из которых функционирует для переноса определённой группы близких по строению аминокислот:

•  нейтральных, с короткой боковой цепью (аланин, серин, треонин);

•  нейтральных, с длинной или разветвлённой боковой цепью (валин, лейцин, изолей-цин);

•  с катионными радикалами (лизин, аргинин);

•  с анионными радикалами (глутаминовая и аспарагиновая кислоты);

•  иминокислот (пролин, оксипролин). Причём к числу Na⁺-зависимых относятся

переносчики аминокислот, входящих в первую и пятую группы, а также переносчик метионина. Независимые от Na⁺ переносчики специфичны для некоторых нейтральных аминокислот (фенилаланин, лейцин) и аминокислот с катионными радикалами (лизин).

Общая схема источников и путей расходования аминокислот в тканях. Экзогенный и эндогенный пул аминокислот

Катаболизм аминокислот – внутриклеточный процесс, в котором выделяют два варианта:

1. Общие пути катаболизма, в результате которых все аминокислоты могут первично терять α-аминогруппу (дезаминирование, трансами-нирование) или α-карбоксильную группу (декарбоксилирование).

2. Индивидуальные пути катаболизма, при которых имеют место пе-ричные превращения аминокислоты по радикалу (трансметилирова-ние, де- и транссульфирование, гидроксилирование и др.).

Пути использования аминокислот после всасывания:

1. Синтез специфических белков тканей, плазмы крови, ферментов, гормонов.

2. Синтез углеводов (глюконеогенез).

3. Синтез липидов.

4. Синтез гистамина, серотонина, креатина, порфиринов, холина, адреналина, пуриновых, пиримидиновых нуклеотидов.

5. Синтез мочевины.

6. Оставшиеся неиспользованные аминокислоты подвергаются распаду с выделением энергии (10-15%).

Общие пути распада аминокислот:

1. Декарбоксилирование;

2. Трансаминирование;

3. Дезаминирование;

Конечными продуктами катаболизма аминокислот являются аммиак, вода и углекислый газ.

А ммиак – токсичное соединение, особенно для центральной нервной системы. Это судорожный яд, требующий постоянного обезвреживания. Механизм токсического действия аммиака сводится к следующему:

1. на обезвреживание аммиака расходуется α-кетоглутаровая кислота, это приводит к выключению ее из цикла трикарбоновых кислот, блокаде ЦТК и развитию гипоэнергетического состояния,

2. повышенная концентрация аммиака в крови (гипераммониемия) приводит к нарушению кислотно-основного состояния, развивается алкалоз,