Чашку Петри при взятии из нее микробной культуры берут в левую руку. Дно чашки, расположенное на ладони, придерживают III, IV, и V пальцами, а большим и указательным пальцами приподнимают крышку так, чтобы через образующуюся щель между дном и крышкой чашки можно было ввести петлю. После взятия материала и приготовления мазка петлю прожигают на огне, а пастеровскую пипетку опускают в дезинфицирующий раствор.
1. Приготовление мазка из культур с плотный питательных сред. На середину чистого, хорошо обезжиренного стекла наносят каплю водопроводной воды, в нее вносят бактериальную петлю с небольшим количеством исследуемой микробной культуры так, чтобы капля жидкости стала туры слегка мутноватой. После этого излишек микробного материала на петле сжигаются в пламени горелки и приступают к приготовлению мазка.
2. Приготовление мазков из органов тканей. При исследовании органа, имеющего рыхлую обеззараживания прижигают на каленными браншами пинцета, делают по этому месту надрез и из глубины остроконечными ножницами вырезают небольшой кусочек ткани, который помещают между двумя предметными стеклами. Далее поступают так же, как при приготовлении мазка из гноя и мокроты. Есл ткань органа плотная, то из глубины разреза делают скальпелем соскоб. Полученный при соскабливании материал распределяют тонким слоем по поверхности стекла скальпелем или бактериальной петлей.
Для изучения взаимного расположения элементов ткани и находящихся
в ней микроорганизмов делают мазки отпечатки. Для этого вырезанный из середины органа небольшой кусочек прикладывают поверхностно среза к предметному стеклу несколько раз последовательно, получая таким образом ряд мазков-отпечатков.
Высушивание и фиксирование мазков. Приготовленный на предметном стекле мазок высушивают на воздухе. При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живы.
Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие коагуляцию белков цитоплазмы.
Под действием жара тел микробных клеток уменьшаются в размере, повреждаются жгутики, происходят глубокие изменения в цитоплазме. Поэтому при изучении строения бактериальной клетки прибегают к химическим способам фиксации.
Физический способ фиксации. Предметное стекло с препаратам берут с пинцетом или большим и указательным пальцами правой руки за ребра мазком кверху и плавным движением проводят 2-3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 5-6 секунд; непосредственному воздействию огня мазок подвергается не более 2 секунд. При более длительном подогревании мазка цитоплазма микробных клеток претерпевает глубокие изменения и утрачивает способность окрашиваться. Надежность фиксации проверяют следующим простым приемом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога.
Химический способ фиксации. Для фиксации мазков применяют следующее химические вещества и соединения.
|
№ |
Фиксирующее вещество |
Время фиксации в минутах |
|
|
1 |
Безводный метиловой спирт |
5 |
|
|
2 |
Этиловой (винный) спирт 950 |
10-15 |
Для фиксации предметное стекло с высушенным мазкам погружают в склянку с фиксирующим веществом и затем высушивают на воздух.
Техника окраски мазков. Для окраски мазков пользуются растворами красок или красящей бумагой, предложенной А.Синевым. Простота приготовления, удобство применения, а также возможность хранения красящих бумаг в течение неограниченно долгого времени явились основанием для широкого их использования при различных способах окраски.
Рецепты приготовления красок и реактивов, необходимых для окрашивания бактериальных препаратов.
Принцип приготовления насыщенных спиртовых растворов красок. В основе рецептов приготовления многих красящих растворов лежит применение насыщенных спиртовых растворов красок, изготовление которых очень просто и в принципе одинаково для всех красителей.
Порошки красок в количествах, указанных ниже конкретно для каждого красителя, высыпают во флаконы, замывают спиртом, и ставят на 18-24 часа в термостат при 370, периодически взбалтывая. В течение указанного времени значительная часть краски растворяется и на дне флакона остается мышь небольшой осадок, свидетельствующий о насыщении раствора.
Насыщенные растворы могут хранится долгое время во флаконах из темного стекла.
Принцип изготовления спирто - водных красок. Спирто-водные растворы красок готовят их насыщенных спиртовых растворов. Для этого насыщенный спиртовой раствор краски смешивают в различных соотношениях (в зависимости от красителя) с дистиллированной водой.
Кристалл виолет
Кристалл виолет - насыщенный спиртовой раствор
Кристалвиолет 10,0
Спирт этиловый 100,0
Вместо кристалвиолета можно пользоваться красками генциан - или метилволета.
Кристалвиолет - спирто - водный раствора
1 мл. насыщенного спиртового раствора разбавляют 10 мл дистиллированной воды.
Кристалвиолет - карболовый раствор.
Кристалвиолет 1г.
Карболовая кислота кристаллическая 2
Спирт 960 20мл.
Вода дистиллированная 100 мл.
Карболовый раствор кристалл (генциан или метил) - виолета готовят аналогично первой прописи карболового раствора фуксина Циля или следующим образом: смешивают 10 мл насыщенного спиртового раствора краски со 100 мл карболовой кислоты; полученную смесь тщательно взбалтывают и фильтруют через бумажный фильтр. Растворы кристалл (метил, генциан) - виолета нестойкие, поэтому их приготовление в большом количестве с расчетом на длительное хранение не рекомендуется.
Фуксин
Фуксин - насыщенный спиртовой раствор.
Основной фуксин 8-9г.
Спирт этиловый 960 100мл.
Фуксин - спирто- водный раствор
1 мл насыщенного спиртового раствора фуксина разбавляют 10 мл дистиллированной воды.
Фуксин Циля - карболовый.
Основной фуксин в порошке 1г.
Карболовая кислота кристаллическая 5
Глицерин 0,5 мл
Спирт 960 10
Вода дистиллированная 100
Метиленовая синь
Насыщенный спиртовой раствор метиленовой сини
Метиленовая синь 8-9 г.
Спирт этиловый 960 100
Метиленовая синь - спирто - водный раствор
1 мл насыщенного спиртового раствора метиленовой сини разбавляют 30 мл дистиллированной воды.
Метиленовая синь (Леффлера)
Насыщенный спиртовой раствор метиленовой сини 30 мл.
Дистиллированная вода 100
Едкое кали 1% 1
Насыщенный раствор метиленовой сини фильтруют через бумажный фильтр, прибавляют к нему едкое кали и разбавляют дистиллированной водой. Приготовленный таким образом раствор краски может храниться во флаконе в течение длительного времени, не изменяя свойств.
Краска Романовского - Гимзы
Краска Романовского - Гимзы представляет собой смесь красителей: азура (органической краски, получаемой из метиленовой сини), эозина и метиленовой сини. В растворенном виде краска имеет фиолетово - синий цвет.
Окраска мазков растворами красок. На высушенный и фиксированный препарат наносят пипеткой краску в таком количестве, чтобы она покрывала весь мазок. При окраске мазков концентрированными растворами красок (карболовым фуксином Циля, карболовым генциан - или кристалвиолетом) окрашивание производят через фильтровальную бумагу, задерживающую части краски: на фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги и на нее наливают раствор краски.
Окраска мазков красящей бумагой. На высушенный и фиксированный препарат наносят несколько капель воды, кладут окрашенные бумажки, нарезанные заранее прямоугольниками величиной 2х2 см. В течение всего времени прокрашивания бумага должна оставаться влажно и плотной прилегать к поверхности стекла. При избытке воды между мазком и красящей бумагой (бумага «плавает») окрашивания микробных клеток не происходит вследствие недостаточной концентрации красящего вещества в воде. При подсыпании бумагу дополнительно смачивают водой. Продолжительность окрашивания мазка определяется методом окраски. По окончании окраски бумагу осторожно снимают пинцетом, а мазок промывают водопроводной водой и подсушивают на воздухе или фильтровальной бумагой.
Простая окраска
При простых способах окраски применяется какая-нибудь одна краска: метиленовая синяя или спирто-водный раствор фуксина. Время окраски препарата зависит от красящего вещества: спирто-водным растворам фуксина красят 1-2 минуты, метиленовой синий -3-5 минут. Окрашенные препараты промывают водопроводной водой, подсушивают на воздухе или осторожно промокают фильтровальной бумагой и микроскопируют с иммерсионной системой.
Простыми способами окраски пользуются для обнаружения в микроскопируемом материале микробов, определения их количества, формы и расположения. Препараты, содержащие, кроме бактерий, тканевые и клеточные элементы, лучше красить метиленовой синей, которая окрашивает фон препарата значительно слабее, чем тела микробных клеток.
Сложные дифференциальные методы окраски
При сложны способ окраски на мазок воздействуют двумя красящими веществами, из которых одна краска является основной, а вторая - дополнительной. Кроме красящий веществ, при сложных способах окраски применяют различные обеспечивающие вещества: спирт, кислоты и.т.д.
Окраска по методу Грамма
Особенностью окраски по методу Грамма является неодинаковое отношение различных микробов к красителем трифенилметановой группы: генциан виолету, метилвиолету, кристалвиолету.
Микробы, входящие в группу грамположительны, например стафилококки, дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. Окрашенные микробы не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом вследствие чего при дополнительной окраске фуксином грамположительные микробы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет. Грамотрицательные микроорганизмы: гонококки, мекингококки, возбудители кишечных заболеваний и др. Образуют в генциан -, кристалл - или метилвиолетом и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение, в результате чего они обесцвечиваются и затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.
Отношение микроорганизмов к окрашиванию по Грамму имеет большое диагностическое значение.
Окраска по Грамму производится следующим образом.
1. На мазок, фиксированный на огне, кладут фильтровальную бумагу и наливают избыток основного красителя-карболового кристалвиолета. Покрашивание делится 1-2 минуты.
2. Снимают бумагу, сливают избыток краски и, не промывая препарата водой, наливают раствор Люголя на 1-2 минуты до почернения препарата.
3. Раствор Люголя сливают. Предметное стекло для обесцвечивания мазка погружают повторно в стаканчик со спиртом. Процесс обесцвечивания считается завершенным, когда от мазка перестают отделяться окрашенные в фиолетовый цвет струйки жидкости.
4. Препарат тщательно промывают водопроводной водой.
5. Докрашивают спирто-водным раствором фуксина в 2 течение 2 минут.
6. Промывают водой, высушивают, микроскопируют.
Результаты окраски: грамположительные бактерии окрашиваются
основной краской в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательную окраску, приобретают ярко-малиновый цвет.
Окраска по Романовскому-Гимзе
Краска Романовского-Гимзы состоит из смеси азура, эозина и метиленовой сини. Непосредственно перед употреблением к 10 мл дистиллированной воды нейтральной или слабо щелочной реакции (рН 7,0-7,2) прибавляют 10 капель продажной краски Романовского-Гимзы. Приготовленный раствор краски тот час же наливают (стекло) на фиксированный мазок или, что лучше, предметное стекло с окрашиваемым препаратом погружают в стаканчик с краской. Через 1 час краску сливают, препарат промывают водой и высушивают на воздухе.
Краска Романовского-Гимзы, имеющая в растворе сине-фиолетовый цвет, окрашивает цитоплазму форменных элементов ткани в голубовато-синий цвет, а ядро клеток, так же как и микробные тела, в фиолетово-красный.
Патогенные свойства возбудителя паратифа.
Морфологические свойства культур изучали на окрашенных мазках, сделанных с внутренних органов цыплят, а также с выделенных колоний микробов. Окрашивали по Грамму. Находили палочки с закругленными концами одиночными, реже парными. В висячной капле подвижные.
Как видно из таблицы все 6 культур с образованием кислоты и газа ферментировали глюкозу и манит, с образованием кислоты - арабинозу, мальтозу, сорбит, ксилозу, дульцит; 4 культуры ресщеплями инозит с образованием кислоты; культуры не сбраживали лакзоту, раффинозу, сахарозу, левулезу, галактозу. Молоко не свертывали, индол не образовывали. Сероводород образовывали только 5 культур из 6. Следовательно, выделенные культуры по биохимическим свойствам относились к сальмонеллам групп В.
Для определения патогенных свойств возбудителя паратифа птиц мы брали только 6 культур. S.typhimurium.
Заражающую дозу проверяли на цыплятах разного возраста. Для этого, как и в предыдущих опытах, было взято 10 цыплят и 3 кур, которых заражали внутримышечно по 0,2-0,5 мл. суточной агаровой микробной взвести. Одновременно аналогичный опыт проводили на белых мышах. За зараженными птицами и мышами наблюдали 15 дней. (табл).
Культура S.typhimurium, введенная цыплятами при разных количествах микробных тел, оказалось более слабой. Смертельная доза для цыплят равнялась 1-3 мирд. Микробных тел. Цыплята 9-дневного возраста погибали после введения им до 200 млн. микробных тел S.typhimurium. Среди цыплят 1-6-суточного возраста культура в дозе 5-10 млн. микробных тел вызывала частичную гибель. Поли только 2 курицы на 12-13 день после введения им 15 млрд. микробных тел.