Рис. 20. Эффекты NaHS на вызванную секрецию медиатора в условиях увеличенной концентрации цГМФ и при ингибировании гуанилатциклазы.
Изменения квантового состава токов концевой пластинки под действием NaHS (100 мкМ) в контроле, на фоне аналога цГМФ - pCPT-cGMP (100 мкМ), и ингибитора гуанилатциклазы - ODQ (100 мкМ). [Ca2+]о =0.2-0.4 мМ, * - p<0.05
Исследование роли рианодиновых рецепторов внутриклеточных Са2+-депо в эффектах H2S на секрецию медиатора. Для выявления влияния сероводорода на рианодиновые рецепторы (Ри-рецепторы) внутриклеточных Са2+-депо использовали активатор Ри-рецепторов - кофеин и ингибитор Ри-рецепторов - дантролен (F. Znao et al., 2001; О.П. Балезина, 2002). Кофеин сенсибилизирует Ри-рецептор к ионам Са2+ и открывает Са2+-канал (B.Ehrlich et al., 1994). В условиях нормального содержания Са2+ (1.8 мМ) в растворе кофеин (3 мМ) вызывал увеличение амплитуды ТКП до 145.6±17.8% (n=5; р<0.05) относительно контроля. Аппликация NaHS на фоне действия кофеина не приводило к достоверному изменению амплитуды ТКП (Рис. 21 А).
Аппликация дантролена (25 мкM) вызывала уменьшение секреции медиатора из нервной терминали. Амплитуда ТКП к 30 минуте действия дантролена уменьшалась до 65.610.1% (n=4; p<0.05) относительно контроля. На фоне блокирования Ри-рецепторов добавление NaHS не приводило к увеличению амплитуды ТКП (Рис. 21 Б).
Таким образом, активация и блокирование Ри-рецепторов эндоплазматического ретикулума предотвращало усиление вызванного освобождения медиатора при действии сероводорода.
Влияние субстрата и блокаторов синтеза H2S на секрецию медиатора из двигательного нервного окончания лягушки. L-цистеин является основным субстратом эндогенного синтеза сероводорода в тканях (K.N. Maclean, E. Kraus, 2004). Аминооксиацетиловая кислота (AOAК) - ингибитор цистатионин в-синтазы (CBS) и в-цианоаланин (в-ЦА) - ингибитор цистатионин г-лиазы (CSE), широко используются для блокирования эндогенного синтеза сероводорода (A.E. Braunstein et al., 1971; B. Teague et al., 2002).
А
Б
Рис. 21. Эффекты NaHS на вызванную секрецию медиатора в условиях активации и ингибировании рианодиновых рецепторов.
А - Изменение амплитуды токов концевой пластинки на фоне действия активатора Ри-рецепторов - кофеина (3 мМ) и NaHS (100 мкМ), апплицированного на фоне кофеина.
Б - Изменение амплитуды токов концевой пластинки на фоне действия ингибитора Ри-рецепторов - дантролена (25 мкМ) и NaHS (100 мкМ), апплицированного на фоне дантролена. Время действия вещества показано сплошной линией. [Ca2+]о = 1.8 мМ
Аппликация субстрата синтеза сероводорода L-цистеина (1 мМ) приводила к увеличению амплитуды ТКП до 117.8±2.3% (n=5; р<0.05) по отношению к контролю (Са2+ - 1.8 мМ) (Рис. 22 А). Ингибиторы ферментов синтеза сероводорода приводили к противоположным эффектам: в-цианоаланина (1 мМ) уменьшал амплитуду ТКП до 63.4±13.4% (n=5; p<0.05) (Рис. 22 Б), аминооксиацетиловая кислота (1 мМ) - до 63.4±16.7% (n=5; p<0.05) относительно контроля (Рис. 22 Б).
Полученные данные указывают на возможность эндогенного синтеза H2S в области нервно-мышечного синапса.
Влияние донора H2S и блокаторов синтеза H2S на секрецию медиатора из двигательного нервного окончания мыши.
Следующей задачей нашего исследования было выявить ферменты синтеза сероводорода в скелетных мышечных волокнах. Для выявления CBS и CSE в различных тканях обычно используют метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией, что связано с отсутствием коммерчески доступных антитела к этим ферментам. Однако, этот метод возможно использовать только на животных с известным геномом, например, на мышах.
Рис. 22. Эффекты субстрата и блокаторов ферментов синтеза H2S на вызванную секрецию медиатора в нервно-мышечном синапсе лягушки.
А - Изменение амплитуды токов концевой пластинки при действии субстрата синтеза H2S - L-цистеина (1мМ). Б - Влияние блокаторов ферментов синтеза H2S в-цианоаланина (в-ЦА, 1 мМ) и аминооксиацетиловой кислоты (АОАК, 1 мМ) на амплитуду токов концевой пластинки. [Ca2+]о =1.8 мМ, * - p<0.05.
Поэтому нами были проведены эксперименты с выявлением эффектов экзогенного газа и блокаторов его синтеза на нервно-мышечном препарате диафрагмальной мышцы мыши. Аппликация NaHS (100 мкМ) вызывала быстрое и обратимое увеличение спонтанной и вызванной секреции медиатора ([Ca2+]0 - 1.8 мМ). Частота МПКП повышалась до 189.0±35.6% (n=7, p<0.05) относительно контроля (Рис. 23 Б), без изменения амплитудно-временных параметров МПКП. Амплитуда ПКП увеличивалась до 186.7±15.6% (n=5; p<0.05) относительно контроля (рис. 23А). Блокирование ферментов синтеза H2S приводило к противоположным эффектам. в-цианоаланин (1 мМ) снижал амплитуду ТКП до 73.4±8.9% (n=5; p<0.05), аминооксиацетиловая кислота (1 мМ) - до 69.0±9.0% (n=5; p<0.05) относительно контроля.
Таким образом, донор H2S усиливает секрецию медиатора из двигательного нервного окончания мыши, а блокаторы ферментов синтеза H2S оказывают противоположные эффекты, что предполагает его эндогенный синтез и модулирующее влияние на нервно-мышечную передачу и у теплокровных животных.
Рис. 23. Эффекты NaHS на вызванную и спонтанную секрецию медиатора в нервно-мышечном синапсе мыши.
А- Изменение амплитуды потенциалов концевой пластинки при действии NaHS. На вкладке усредненные потенциалы концевой пластинки (10 реализаций) в контроле и при действии NaHS (100 мкМ) в отдельном эксперименте. Б - Влияние NaHS на частоту миниатюрных потенциалов концевой пластинки. Время действия вещества показано сплошной линией. [Ca2+]о =1.8 мМ, * - p<0.05.
Выявление ферментов, генерирующих сероводород, в скелетной мышце мыши методом полимеразной цепной реакцией с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). При введении в реакцию ОТ-ПЦР препаратов мРНК, полученных из диафрагмы мыши, на электрофореграмме были выявлены фрагменты ДНК лежащие в области 320-330 (n=3) и 240-250 (n=3) п.о. Обнаруженные фрагменты по своему размеру соответствуют теоретически ожидаемым 325 п.о. - для мРНК CSE и 232 п.о. - для мРНК CBS (Рис. 24 А Б, колонка 1).
Амплификационный синтез ДНК отсутствовал в образцах, предварительно обработанных рибонуклеазой А, что свидетельствует о том, что молекулярной мишенью в реакции ОТ-ПЦР служила мРНК, а не геномная ДНК (Рис.24, колонка 3). Для проверки специфичности реакции ОТ-ПЦР, образовавшиеся амплификоны были обработаны рестриктазой HaeIII, которая разрезает продукт реакции в строго определенном участке (см. Методы). В дальнейшем полученные фрагменты были подвергнуты электрофоретическому разделению. Амплификон размером 325 п.о. был расщеплен на фрагменты с размерами, близкими к теоретически ожидаемым (78 и 247 п.о.).
Рис. 24. Выявление мРНК CSE и CBS в диафрагме мыши методом полимеразно-цепной реакции с обратной транскрипцией
А- электрофореграмма для мРНК CSE;Б- электрофореграмма для мРНК CBS;
М - маркер молекулярных размеров; 1 - фрагмент кДНК, специфичный мРНК CSE или CBS 2 - фрагменты кДНК, полученные в результате разделения исходного амплификона рестриктазой HaeIII в определенных участках; 3 - полимеразно-цепная реакция отсутствововала в образцах, обработанных рибонуклеазой А; 4 - отрицательный контроль (деионизованная вода).
При анализе размеров продуктов рестрикции фрагмента 232 п.о. на электрофореграмме выявлены полосы, соответствующие фрагментам с массой 39 и 193 п.о., что соответствует теоретически ожидаемым (Рис. 24, колонка 2). На основании полученных результатов можно сделать вывод об экспрессии мРНК CSE и CBS в изученных образцах.
Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что экзогенный H2S оказывает облегчающее влияние на спонтанное и вызванное освобождение медиатора в нервно-мышечном синапсе лягушки и мыши. С использованием активатора и ингибитора Ри-рецепторов было показано, что основным механизмом облегчающего влияния H2S является активация рианодиновых рецепторов внутриклеточных Са2+-депо. Участие цАМФ в эффектах газа может быть связано с активации протеинкиназы А, которая регулирует внутриклеточный уровень Са2+, фосфорилируя субъединицы потенциалзависимых кальциевых каналов и рианодиновых рецепторов (D.M. Terrian, 1995). Нельзя исключать и возможности непосредственного вмешательства H2S в механизмы экзоцитоза синаптических везикул, связанных с трансформацией белков SNARE-комплекса, о чем свидетельствует увеличение частоты МПКП. Выявлена экспрессия мРНК ферментов синтеза сероводорода в диафрагмальной мышце мыши. Синтез H2S регулируется как на уровне экспрессии ферментов CSE и CBS в тканях, так и путем изменения их активности (E. Lowicka, J. Beltowski, 2007). В нервной системе электрическая стимуляция и глутамат увеличивают активность CBS Ca/кальмодулин-зависимым образом (K. Eto et al., 2002). Деполяризация мембраны нервного окончания или мышечных волокон может приводить к эндогенному синтезу H2S и усилению освобождения медиатора.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В ходе исследования роли газообразных посредников в модуляции синаптической передачи мы проанализировали эффекты и механизмы влияния NO, СО и H2S на освобождение медиатора из двигательного нервного окончания. Газообразные посредники образуют особую группу веществ, имеющих ряд свойств, отличающих их от классических медиаторов (R.Wang, 2002, 2004). Все они легко проникают через мембрану, выделяются из любого участка клетки, не запасаются в везикулах и не освобождаются экзоцитозом, являются коротко живущими. Клеточные эффекты газов опосредуются либо через систему внутриклеточных посредников, либо через прямое влияние на субъединицы ионных каналов, белки экзоцитоза, внутриклеточные ферменты. В роли нейромедиаторов и нейромодуляторов газы имеют преимущества перед другими посредниками по скорости синтеза и выделения, степени проницаемости через мембрану и широкому спектру мишеней (R.Wang, 2002). Особенности действия газов позволяют предположить их важную роль в формировании кратковременных и долговременных изменений в синаптических структурах в процессах памяти и обучения. Нами было показано, что оксид азота и монооксид углерода оказывают разнонаправленное действие на секрецию медиатора из двигательного нервного окончания. NO уменьшает освобождение ацетилхолина и усиливает потенциалзависимые калиевые токи нервного окончания. СО вызывает усиление высвобождения медиатора без изменения электрогенеза нервной терминали. Известно, что оба газа являются активаторами растворимой формы гуанилатциклазы. При этом микромолярные концентрации NO усиливают активность гуанилатциклазы в 100 раз, тогда как СО является слабым активатором фермента, увеличивая его активность в миллимолярных концентрациях только в 4 раза (J.A.Stone, M.A.Marletta, 1994). В ходе наших экспериментов было показано, что изменение активности гуанилатциклазы опосредует эффекты NО и CO в двигательном нервном окончании, однако, существуют и другие мишени их действия. Известно, что цГМФ осуществляет перекрестное взаимодействие цАМФ и цГМФ-зависимых систем через цГМФ-регулируемые фосфодиэстеразы (ФДЭ II и ФДЭ III). Активация того или иного сигнального пути будет зависеть от базальной активности гуанилатциклазы, аденилатциклазы и внутриклеточной локализации ферментов. Полученные нами данные позволяют предположить, что эффект NO реализуется через активацию ФДЭ II, что ведет к уменьшению уровня цАМФ и снижению секреции медиатора. Образование СО ведет к запуску другого внутриклеточного пути - ингибированию ФДЭ III и активации синтеза цАМФ, что приводит к повышению уровня циклического нуклеотида и увеличению вызванной секреции медиатора. Действительно, эффекты как NO, так и CO полностью предотвращались увеличением уровня цАМФ.
Третий газ - H2S только недавно начал интенсивно исследоваться в качестве эндогенного посредника, механизмы его действия практически не известны (E. Lowicka, J. Beltowski, 2007). Проведенные нами исследования впервые показали, что сероводород и его донор - гидросульфид натрия приводят к усилению секреции медиатора из двигательного нервного окончания, не изменяя электрогенеза нервной терминали. Основной точкой приложения H2S является изменение уровня внутриклеточного кальция за счет активации рианодиновых рецепторов эндоплазматического ретикулума нервного окончания.
По-видимому, все три газа могут синтезироваться в области нервно-мышечного синапса. Об этом свидетельствуют эксперименты как с блокированием ферментов синтеза газов, так и выявлением ферментов их синтеза в исследуемом препарате. Так, известно, что м-форма нейрональной NO-синтазы экспрессируется в области концевой пластинки и связана с дистрофиновым гликопротеиновым комплексом мембраны мышечного волокна. Нами была выявлена конститутивная форма гем-оксигеназы 2 в скелетных мышечных волокнах лягушки, а также показана экспрессия мРНК ферментов синтеза сероводорода в скелетных мышечных волокнах диафрагмы мыши.
Известно, что регуляция активности ферментов синтеза газов может происходить как кратковременно - в ответ на повышение уровня Са2+ и активацию протеинкиназ, так и долговременно - на уровне экспрессии генов (R.Wang, 2004). Активация этих ферментов в ответ на повышение уровня Са2+, например при сокращении мышцы будет приводить к синтезу газообразного посредника, который диффундируя через синаптическую щель, будет оказывать влияние на выделение медиатора, оказывая положительную или отрицательную обратную связь в системе нервное окончание аксона - скелетная мышца. О возможности эндогенного синтеза газов свидетельствуют и эксперименты с блокаторами NO-синтазы, гем-оксигеназы, CBS и CSE. Все они вызывали эффекты, противоположные действию соответствующего газа или донора, хотя выраженность эффектов была меньшей по сравнению с действием экзогенного газа. По-видимому, даже в условиях одиночной стимуляции имеется тоническая активность ферментов, приводящая к синтезу газа, и этот синтез осуществляется вблизи нервного окончания - в области нервно-мышечного синапса.
Имеются данные о тесном взаимодействии газов, как на уровне регуляции синтеза, так и мишеней действия. Показано, что СО и H2S связываются с NO-синтазой, ингибируя ее активность. CBS - является одной из предполагаемых мишеней действия CO. NO модулирует синтез H2S усиливая экспрессию фермента CSE в тканях (R.Wang, 2004, Wu, Wang, 2006, E. Lowicka, J. Beltowski, 2007). Газы могут взаимодействовать друг с другом, поэтому необходимо рассматривать все три газа как единую систему посредников, регулирующих функцию синапса.