Для выявления стереоспецифичности эффектов L-аргинина исследовали его правовращающийся оптический изомер - D-аргинин в концентрациях 100 мкМ и 1000 мкМ. D-аргинин в концентрации 100 мкМ вызывал увеличение квантового состава ТКП до 225±3.2%, а в концентрации 1000 мкМ до 392±22.8% (n=5; p<0.05) по сравнению с контролем (Рис.5 А). При этом происходило уменьшение 3-ей фазы ответа нервного окончания до 92±2.3% при действии D-аргинина в концентрации 100 мкМ и до 68.4±8.1% (n=5; p<0.05) при действии D-аргинина в концентрации 1000 мкМ (n=5; p<0.05) (Рис.5 Б). Таким образом, D-аргинин в обеих концентрациях дозозависимо увеличивал квантовый состав и уменьшал амплитуду третьей фазы ответа. Эффекты D-аргинина аналогичны эффектам ингибирования NО-синтазы, что, по-видимому, связано со стереохимической специфичностью фермента синтеза NO. Действительно, на фоне действия L-NAME D-аргинина в обеих концентрациях не изменял ни секрецию медиатора, ни амплитуды 3-ей фазы ответа нервного окончания.
Таким образом, выявлены существенные различия между эффектами стереоизомеров аргинина на секрецию медиатора и ионные токи двигательного нервного окончания лягушки. Предположено, что L-аргинин в больших концентрациях усиливает секрецию медиатора за счет ингибирования синтеза NO, однако, имеются и другие механизмы его влияния, которые могут быть связаны как с непосредственным действием L-аргинина на внутриклеточные мишени, так и с образованием метаболитов, имеющих собственные эффекты.
Рис. 5. Эффекты D-аргинина на фоне блокирования NO-синтазы.
Изменение квантового состава ТКП (белый столбик) и третьей фазы ответа нервного окончания (заштрихованный столбик) при действии D-аргинина (D-арг) в концентрациях 100 мкМ и 1000 мкМ, L-NAME (100 мкМ), D-аргинина (100 и 1000мкМ) на фоне действия L-NAME.
По оси ординат - изменение квантового состава ТКП или третьей фазы ответа нервного окончания в % относительно исходных значений. [Ca2+]0 - 0.2-0.4 мМ, * - p<0.05
Исследование роли гуанилатциклазной системы в эффектах NO на секрецию медиатора и ионные токи нервного окончания. Для повышения внутриклеточной концентрации цГМФ использовали мембранопроникающие аналоги: 8Br-cGMP, db-cGMP и селективный ингибитор цГМФ-специфичной фосфодиэстеразы - запринаст. Аппликация аналогов цГМФ (100 мкМ или 1 мМ) и запринаста (100 мкМ) не приводила к изменению ни параметров ответа нервного окончания, ни квантового состава ТКП (Рис. 6). SNP после часовой инкубации нервно-мышечного препарата в растворе Рингера, содержащего 8Br-cGMP, db-cGMP или запринаст, не изменял достоверно ни амплитуды 3-ей фазы ответа нервного окончания, ни амплитуду и квантовый состав ТКП в течение всего эксперимента (Рис. 6). Селективный блокатор гуанилатциклазы - ODQ в концентрации 0.1 мкМ вызывал достоверное снижение вызванной секреции медиатора - квантовый состав ТКП уменьшился до 73.92.3% (n=6; p<0.05) относительно контроля. В условиях сниженной активности гуанилатциклазы эффекты SNP сохранялись, но были менее выражены, чем в контроле: квантовый состав ТКП снижалась до 41.11.4% (n=6; p<0.05), амплитуда 3-ей фазы ответа нервного окончания возрастала до 160.95.8% (n=6; p<0.05) относительно контроля (Рис.6 А, Б).
А
Б
Рис. 6. Влияние изменения активности гуанилатциклазной системы на эффекты донора оксида азота - SNP на вызванную секрецию медиатора и потенциалзависимые калиевые токи нервного окончания.
Изменение квантового состава ТКП (А) и амплитуды 3 фазы ответа нервного окончания (Б) при действии донора NO (SNP, 100 мкМ), блокатора гуанилатциклазы (ODQ, 0.1 мкМ), SNP на фоне действия ODQ, аналога цГМФ (8Br-cGMP, 100 мкМ) и SNP на фоне 8Br-cGMP.
За 100% уровень приняты значения квантового состава ТКП и амплитуды 3 фазы ответа в контроле - до аппликации соответствующих веществ. [Ca2+]0 - 0.2-0.4 мМ, * - p<0.05.
Таким образом, повышение внутриклеточной концентрации цГМФ снимало эффекты NO на секрецию медиатора и потенциалзависимые К+-токи, а в условиях пониженного синтеза цГМФ эффекты NO были менее выражены, чем в контроле. Можно предположить, что повышение концентрации цГМФ опосредует модулирующие эффекты NO на синаптическую передачу, но существуют и цГМФ-независимые эффекты NO.
Исследование роли аденилатциклазной системы в эффектах NO на секрецию медиатора и ионные токи нервного окончания. Добавление 8Вr-cAMP (100 мкМ) вызывало прогрессирующее увеличение амплитуды и квантового состава ТКП до 189.37.8% и 155.813.1% (n=10; р<0.05), соответственно, относительно контроля, не изменяя ответа нервного окончания (Рис. 7 Б). На фоне повышенной внутриклеточной концентрации цАМФ (часовая инкубации препарата в растворе Рингера с 8Br-cAMP) SNAP не вызывал достоверных изменений ни квантового состава ТКП, ни амплитуды третьей фазы ответа (Рис. 7 Б). Специфический ингибитор аденилатциклазы - MDL-12330A в концентрации 1 мкM вызывал уменьшение секреции медиатора без изменения параметров ответа нервного окончания. Квантовый состав ТКП при действии MDL-12330A уменьшался до 31.74.9% (n=5; p<0.05), относительно контроля.
А
Б
Рис. 7. Роль аденилатциклазной системы в эффектах NO на секрецию медиатора и третью фазу ответа нервного окончания.
А - Изменения квантового состава ТКП при действии MDL-12330A (1 мкМ) и SNАP (250 мкМ) на фоне MDL-12330A. За 100% уровень принят уровень секреции в контроле до воздействия веществ
Б - Изменение квантового состава ТКП (m, ¦) и 3-ей фазы ответа нервного окончания (3 фаза, ?) при добавлении в раствор 8Br-cAMP (100 мкМ) и SNАP на фоне 8Br-cAMP в процентах от исходного уровня. Время действия веществ показано сплошной линией. [Ca2+]0 - 0.2-0.4 мМ, * - p<0.05
В условиях сниженной активности фермента (часовая инкубация нервно-мышечного препарата в растворе с MDL-12330A) эффекты SNАP были выражены в той же степени, что и в контрольных условиях - квантовый состав ТКП снижался до 5.30.6% (n=5; p<0.05), амплитуда 3-ей фазы ответа возрастала до 149.111.4 (n=5; p<0.05) относительно исходных значений. По-видимому, эффекты NO не связаны с непосредственным уменьшением активности аденилатциклазы, а опосредуются влиянием на другие звенья аденилатциклазной системы. Было предположено, что ингибирующее действие NO на вызванную секрецию медиатора и активирующее - на потенциалзависимые К+-токи может опосредоваться через изменение концентрации цАМФ, которая зависит от активности цГМФ-специфичных цАМФ-фосфодиэстераз.
Исследование роли цГМФ-ингибируемой и цГМФ-стимулируемой цАМФ-специфичных фосфодиэстераз в эффектах NO на секрецию медиатора и ионные токи нервного окончания. Внутриклеточная концентрация цАМФ может регулироваться как синтезом соответствующими циклазами, так деградацией фосфодиэстеразами (J.A. Beavo, 1995). Две из них - цГМФ-стимулируемая (ФДЭ-II) и цГМФ-ингибируемая (ФДЭ-III) являются цГМФ-зависимыми и служат для перекрестной связи между цАМФ- и цГМФ-зависимыми сигнальными системами (C.Lugnier, 2006).
А
Б
Рис. 8. Роль цГМФ-зависимых фосфодиэстераз в эффектах NO на вызванное освобождение медиатора и ионные токи двигательного нервного окончания.
Изменение квантового состава ТКП (А) и амплитуды 3 фазы ответа нервного окончания (Б) при действии донора NO (SNAP, 250 мкМ), блокатора фосфодиэстеразы II (milrinone, 20 мкМ), SNAP на фоне милринона (milrinone+SNAP), блокатора фосфодиэстеразы III (EHNA, 50 мкМ) и SNAP на фоне EHNA (EHNA+SNAP [Ca2+]0 - 0.2-0.4 мМ, * - p<0.05
Добавление селективного блокатора цГМФ-ингибируемой цАМФ- фосфодиэстеразы - милринона (20, 100 мкМ) не влияло непосредственно ни на электрогенез нервного окончания, ни на секрецию медиатора. На фоне действия милринона эффекты SNAP на секрецию медиатора и потенциалзависимый К+-ток сохранялись (Рис.8 А, Б).
Блокатор цГМФ-стимулируемой цАМФ-фосфодиэстеразы - erytro-9-(2-hydroxy-3 nonyl)-adenine) hydrochloride (EHNA, 50 мкM) вызывал значительное увеличение амплитуды и квантового состава ТКП до 258.3±16.3% и 382.6±5.1% (n=5; р<0.05), соответственно, от исходной величины (Рис. 8 А). Амплитуда 3-ей фазы достоверно снижалась до 84.2±1.2% (n=5; р<0.05) относительно контроля (Рис. 8 Б). В условиях ингибирования цГМФ-стимулируемой цАМФ-фосфодиэстеразы SNAP уменьшал квантовый состав ТКП до 63.5±6.9% (n=5; p<0.05) по отношению к уровню секреции на фоне EHNA (Рис. 3 А). Амплитуда 3-ей фазы ответа нервного окончания в течение всего эксперимента не изменялись (Рис. 3 Б).
Таким образом, снижение активности цГМФ-стимулируемой цАМФ-фосфодиэстеразы ослабляет ингибиторное действие NO на вызванную секрецию медиатора и устраняет активирующее влияние NO на потенциалзависимые К+-токи.
Исследование роли протеинкиназы А в эффектах NO на ионные токи нервного окончания и вызванную секрецию медиатора. цАМФ-зависимая протеинкиназа или протеинкиназа А опосредует большинство биологических эффектов цАМФ во всех клетках эукариот и является ключевым ферментом аденилатциклазного пути передачи сигнала. Селективный ингибитор протеинкиназы А - Н-89 в концентрации 10 мкМ не изменял параметров ответа нервного окончания, но быстро подавлял вызванную секрецию медиатора. Квантовый состав ТКП снижался до 68.6±6.1% (n=5; p<0.05), относительно исходных величин. На фоне действия Н-89 SNAP уменьшал квантовый состав ТКП - до 36.1±5.5% (n=5; p<0.05) относительно исходной величины, не изменяя амплитуды 3 фазы ответа нервного окончания.
Можно думать, что активация потенциалзависимого калиевого тока при действии NO связана со снижением активности протеинкиназы А, которая также опосредует эффекты NO на вызванную секрецию медиатора.
Таким образом, проведенные эксперименты свидетельствуют, что экзогенный и эндогенный NO оказывает ингибирующее действие на секрецию медиатора из двигательных нервных окончаний лягушки. Действие NO может быть связано как с изменением длительности потенциала действия нервного окончания путем модуляции выходящего К+-тока, так и посредством изменения активности гуанилатциклазного и аденилатциклазного метаболических каскадов. Предположено, что NO активирует растворимую форму гуанилатциклазы, тем самым, увеличивая концентрацию цГМФ. Повышение концентрации цГМФ ведет к активации цГМФ-стимулируемой фосфодиэстеразы и к усилению гидролиза цАМФ. Снижение концентрации цАМФ в нервном окончании снижает активность цАМФ-зависимых протеинкиназ, что, в свою очередь, ведет к уменьшению секреции медиатора и усилению потенциалзависимого К-тока нервного окончания. Не исключено, также, что NO может модулировать потенциалзависимые К+- и Са2+-каналы с внешней и внутренней стороны мембраны путем S-нитрозилирования, образования свободных форм кислорода и пероксинитритов или модуляции Са2+-каналов внутриклеточных депо (В.П.Реутов и др., 1998; B.Gaston, 1999; С.Erxleben, A.Hermann, 2001; A.Schwingshackl et al., 2002).
Исследование влияния и механизмов действия монооксида углерода на освобождение медиатора в нервно-мышечном синапсе
Влияние экзогенного CO на секрецию медиатора и ионные токи двигательного нервного окончания. В условиях двухэлектродной фиксации потенциалов нами было исследовано влияние экзогенного СО на миниатюрные ТКП (МТКП) и ТКП в стандартном растворе Рингера ([Ca2+]0 - 1.8 мМ). Добавление СО (96 мкМ) приводило к быстрому и обратимому увеличению спонтанной секреции медиатора (Рис. 9 Б). Частота МТКП возрастала до 207.0±3.1% (n=5; p<0.05) по сравнению с контролем к 20 минуте эксперимента, амплитудно-временные параметры МТКП не изменялись (Рис. 9 А). При этом происходило увеличение амплитуды ТКП до 245.3±45.2% (n=5; p<0,05) относительно контроля без изменения временных параметров ТКП (Рис.9 А, Б). Так как СО не влиял на амплитудно-временные параметры МТКП и время
Рис. 9. Влияние СО (96 мкМ) на спонтанную и вызванную секрецию медиатора. Усредненные миниатюрные токи концевой пластинки (МТКП) (А) и токи концевой пластинки (ТКП) (В) в контроле и после аппликации СО. Изменение частоты МТКП (Б) и амплитуды ТКП при действии СО (Г).[Ca2+]0 -1.8 мМ, * - p<0.05.
полуспада ТКП можно думать, что его эффекты не связаны с изменением работы ацетилхолинорецепторов постсинаптической мембраны и влиянием на активность ацетилхолинэстеразы.
В условиях сниженной концентрации внеклеточного Са2+ ( [Ca2+]0 - 0.3-0.4 мМ) с использованием внеклеточной регистрации исследовали влияние СО на квантовый состав ТКП и ионные токи двигательного нервного окончания. Аппликация экзогенного СО (96 мкМ) приводила к быстрому и значительному увеличению усредненной амплитуды и квантового состава ТКП (Рис.10 А, В): амплитуда ТКП достигала 188.1±26.7% (n=5; p<0.05), а квантовый состав ТКП - 287.6±17.4% (n=5; p<0.05) относительно контроля (Рис.10 А, В). Эффект газа был обратим и не сопровождался изменением параметров ответа двигательного нервного окончания (Рис.10 А, Б).
Рис.10. Эффекты СО на ионные токи нервного окончания и вызванную секрецию медиатора.
А - суперпозиция ответов нервного окончания и токов концевой пластинки при внеклеточной регистрации в контроле, при действии СО и после отмывки раствором Рингера (по 10 реализаций). Б - изменение квантового состава ТКП при действии СО. Время действия газа показано сплошной линией. В - эффекты СО на амплитуду второй и третьей фазы ответа нервного окончания: потенциалзависимые натриевые (Na-ток) и калиевые токи (Kv-ток) проанализированы в условиях [Ca2+]0 - 0.2-0.4 мМ, кальций-активируемые калиевые токи (K(Ca)) - в условиях [Ca2+]0 - 1.8 мМ, d-тубокурарин (20-30 мкМ), 4-аминопиридин (100 мкМ).Г - дозозависимость эффектов СО на квантовый состав ТКП [Ca2+]0 - 0.2-0.4 мМ.
Для выявления влияния СО на кальций-активируемые калиевые токи исследовали его эффекты на фоне блокирования потенциалзависимых калиевых каналов 4-аминопиридином в условиях нормального содержания ионов кальция в растворе. В данных условиях третья фаза ответа нервного окончания отражает выходящие токи через кальций-активируемые калиевые каналы. Аппликация СО (96 мкМ) не приводила к достоверным изменениям амплитуды 3-ей фазы ответа, что свидетельствует об отсутствии влияния газа на кальций-активируемые калиевые токи нервного окончания (Рис.10 Б).
На Рис.10 Г показана дозозависимость эффектов СО на вызванную секрецию медиатора. Оказалось, что уже в концентрации 0.96 мкМ СО вызывал повышение квантового состава ТКП до 148.7±2.70% (n=5, p<0.05) относительно контроля, в концентрациях 48 и 96 мкм значение квантового состава ТКП выходило на уровень плато, EC50=29.7 мкМ. В последующих экспериментах использовали СО в концентрации 96 мкМ.
Для контроля действующего начала раствора, содержащего СО, проводили эксперименты, выдерживая базовый раствор в течение 2 часов после насыщения при комнатной температуре. В данных условиях раствор не оказывал никакого эффекта на квантовый состав ТКП, что, по-видимому, связано с диффузией газа из раствора.