На правах рукописи
03.00.13 - физиология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Газообразные посредники как эндогенные модуляторы освобождения медиатора в нервно-мышечном синапсе
Ситдикова Гузель Фаритовна
КАЗАНЬ - 2008
Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина» Федерального агентства по образованию и науке РФ
Научный консультант: чл.-корр. РАМН, доктор медицинский наук, проф. Зефиров Андрей Львович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор
Балезина Ольга Петровна
доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Бухараева Элля Ахметовна
доктор биологических наук, профессор Чинкин Абдулахат Серазетдинович
Ведущая организация: Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (г. Москва).
Защита состоится «11 » ноября 2008 г. в «12.00» часов на заседании диссертационного Совета Д 212.078.02 при ГОУ ВПО «Татарский государственный гуманитарно-педагогический университет» по адресу: 420021, г. Казань, ул. Татарстана, 2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Татарский государственный гуманитарно-педагогический университет» по адресу: 420021, г. Казань, ул. Татарстана, 2.
Автореферат разослан «11» октября 2008 г.
Ученый секретарь диссертационного Совета
доктор медицинских наук,
профессор Зефиров Т.Л
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования
В конце прошлого века был открыт новый класс биологически активных веществ - так называемых газообразных посредников, осуществляющих как межклеточную, так и внутриклеточную регуляцию разнообразных физиологических функций (L.J.Ignarro, 1999; E.Baranano et al., 2001; D.Boehning, S.H.Snyder, 2003). В настоящее время к этому классу относят такие газы как оксид азота (II), монооксид углерода и сероводород (M.D.Maines, 2004; R.Wang, 2002). Оказалось, что физиологическое значение газов не ограничивается регуляцией функций желудочно-кишечного тракта и сосудистой системы, где оно было определено первоначально, но распространяется также на центральную и на периферическую нервную систему (Г.Ф.Ситдикова, А.Л. Зефиров, 2006; R.Wang, 2004; G.F.Sitdikova et al., 2007; Е.В.Герасимова и др., 2008).
Оксид азота (II) (NO) был первой газообразной молекулой, открытие которой привело к пересмотру классических представлений о клеточной сигнальной трансдукции (L.J.Ignarro, 1999). NO был сначала идентифицирован как эндотелиальный фактор расслабления сосудов и медиатор бактерицидного действия макрофагов (L.J.Ignarro, 1987). Впоследствии было обнаружено, что глутамат, действуя на НМДА-рецепторы в центральной нервной системе, вызывает высвобождение химического агента, свойства которого сходны со свойствами эндотелиального фактора расслабления сосудов, и были получены доказательства нейрональной роли NO (D.S.Bredt, S.H.Snyder, 1992; J.Garthwaite, C.L.Boulton, 1995). Спустя несколько лет было показано, что NO модулирует секрецию медиаторов в центральной и периферической нервной системе в условиях как in vitro, так и in vivo (E.M.Schuman, D.V.Madison, 1994; H.Prast, A.Philippu, 2001; A.Bishop, J.E.Anderson, 2005). NO является модулятором освобождения ацетилхолина в нервно-мышечных соединениях как холоднокровных, так и теплокровных животных (S.A.Lindgren, M.W.Laird, 1994; А.Л.Зефиров и др., 1999; M.R.Mukhtarov et al., 1999; S.Thomas, R.J.Robitaille, 2001; S.J.Etherington, A.W.Everett, 2004; T.J.Nickels et al., 2007). Основным «рецептором» для NO в различных тканях является растворимая гуанилатциклаза (W.P.Arnold et al., 1977), активация которой приводит к повышению внутриклеточной концентрации цГМФ и соответствующих протеинкиназ (S.Andreopoulos, A.Papapetropoulos, 2000; K.A.Lucas et al., 2000). Значительная неоднородность эффектов NO, их видо- и тканеспецифичность предполагает наличие цГМФ-независимых механизмов реализации функций NO (S.Thomas, R.J.Robitaille, 2001; А.В.Яковлев и др., 2002; T.J.Nickels et al., 2007).
Монооксид углерода (угарный газ, СО) хорошо известен своими токсическими свойствами, однако, оказалось, что СО синтезируется эндогенно в микромолярных концентрациях в результате расщепления гема ферментом гемоксигеназой (M.D.Maines, 1997; 2004). Исследования функций СО как сигнальной молекулы в мозге, были вызваны тем, что активность гемоксигеназы в мозге приближается к таковой в тканях, разрушающих гем эритроцитов (например, в селезенке) (T.Ingi et al., 1996). Впоследствии по аналогии с NO-синтазой было предположено, что одна из функций гемоксигеназы - синтез СО, который активирует растворимую гуанилатциклазу с последующим увеличением уровня цГМФ в ткани (T.Morita, 1995). Однако, CO является слабым активатором растворимой гуанилатциклазы (J.R.Stone, M.A.Marletta, 1994; T.Ingi et al., 1996). По-видимому, в отличие от NO, который является сильным, но коротко живущим стимулятором синтеза цГМФ, СО за счет своей химической стабильности может оказывать хотя и слабые, но долговременные тонические эффекты (L.Wu, R. Wang, 2005). В отличие от кровеносных сосудов, где показаны кооперативные эффекты NO и CO, в некоторых областях мозга они оказывают антагонистическое действие (C.Thorup et al., 1999). Исследование клеточных механизмов регуляции активности гемоксигеназы показало, что синтез СО увеличивается в ответ на повышение цитозольной концентрации кальция, активацию протеинкиназы С и тирозинкиназ (D.Boehning et al., 2003). Показано, что СО также как NO является ретроградным мессенджером, участвующим в развитии и поддержании долговременной потенциации в гиппокампе (M.Zhuo et al., 1999). Исследований влияния СО на синаптическую передачу в системе мотонейрон-скелетная мышца не проводилось.
Предположения о физиологической роли сероводорода (H2S) возникли только в последнее время, что было связано с обнаружением высоких эндогенных концентраций сульфидов в крови и тканях мозга млекопитающих и других позвоночных животных (M.F.Warenycia et al., 1989; W.Zhao et al., 2001; J.E. Doeller et al., 2005). Эндогенно H2S синтезируется из L-цистеина пиридоксаль-5'-фосфат-зависимыми ферментами - цистатионин в-синтазой и цистатионин г-лиазой, экспрессирующимися практически во всех тканях (P.Kamoun, 2004). Также как NO и CO, H2S участвует в расслаблении гладкой мускулатуры (W. Zhao, R. Wang, 2002; B.Teague et al., 2002), физиологические концентрации этого газа усиливают активность НМДА рецепторов и облегчают индукцию долговременной потенциации в гиппокампе (K.Abe, H.Kimura, 1996). Исследования механизмов влияния сероводорода в нервной системе начались совсем недавно, а выявления его роли в периферической нервной системе не проводилось.
По-видимому, газы образуют единую систему посредников, легко проникающих через мембрану и регулирующих ферментативные реакции клетки. Данных о механизмах действия газов в нервной системе очень мало. Исследование внутриклеточных механизмов влияния NO и CO, H2S в системе мотонейрон - скелетная мышца позволит выявить основные мишени их действия при модуляции синаптических функций.
Цель и задачи исследования
Цель настоящего исследования - выяснение роли газообразных посредников - оксида азота (II), монооксида углерода и сероводорода в регуляции секреции медиатора из двигательного нервного окончания и анализ внутриклеточных механизмов действия газов на синаптическую передачу. В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
Изучить эффекты экзогенных и эндогенных доноров NO, субстрата синтеза NO - L-аргинина и блокатора синтеза NO - L-NAME на вызванную секрецию медиатора и электрогенез двигательного нервного окончания лягушки.
Выявить роль системы гуанилатциклазы и аденилатциклазы в эффектах NO на нервно-мышечную передачу.
Проанализировать участие цГМФ-зависимых фосфодиэстераз в реализации эффектов NO на секрецию медиатора и потенциалзависимый калиевый ток нервной терминали.
Изучить эффекты экзогенного монооксида углерода и ингибитора гемоксигеназы на электрогенез нервного окончания и секрецию медиатора.
Выявить роль аденилат- и гуанилатциклазной систем в эффектах монооксида углерода на вызванное освобождение медиатора.
Проанализировать участие цГМФ-зависимых фосфодиэстераз в реализации эффектов СО на секрецию медиатора.
Определить локализацию фермента гемоксигеназы-2 в кожно-грудинной мышце лягушки с помощью иммуногистохимического метода.
Изучить эффекты сероводорода, его донора сероводорода - гидросульфида натрия и блокаторов ферментов синтеза газа на секрецию медиатора и ионные токи двигательного нервного окончания лягушки.
Проанализировать роль системы гуанилатциклазы/цГМФ и аденилатциклазы/цАМФ в эффектах сероводорода.
Выявить роль рианодиновых рецепторов внутриклеточных кальциевых депо в эффектах сероводорода.
Исследовать эффекты сероводорода и блокаторов ферментов синтеза газа на секрецию медиатора в нервно-мышечном синапсе мыши.
Определить экспрессию генов ферментов синтеза сероводорода в диафрагмальной мышце мыши методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией.
Положения, выносимые на защиту
1. Оксид азота (II) угнетает вызванную секрецию медиатора и активирует потенциалзависимые калиевые токи в двигательном нервном окончании лягушки. Гуанилатциклазная и аденилатциклазная внутриклеточные сигнальные системы опосредуют эффекты оксида азота через изменение активности цГМФ-стимулируемой цАМФ-специфичной фосфодиэстеразы (фосфодиэстеразы II).
2. Монооксид углерода вызывает усиление освобождения медиатора в нервно-мышечном синапсе лягушки без изменения электрогенеза двигательного нервного окончания. Эффекты монокосида углерода реализуются через повышение уровня цАМФ за счет активации синтеза аденилатциклазой и снижения деградации циклического нуклеотида посредством цГМФ-ингибируемой цАМФ-специфичной фосфодиэстеразы (фосфодиэстеразы III). аргинин медиатор электрогенез нервный
3. Сероводород усиливает спонтанную и вызванную секрецию медиатора в нервно-мышечном синапсе лягушки и мыши. Активация рианодиновых рецепторов эндоплазматического ретикулума опосредует пресинаптические эффекты сероводорода в нервно-мышечном синапсе лягушки.
4. Газообразные посредники - оксид азота (II), монооксид углерода и сероводород являются пресинаптическими модуляторами освобождения медиатора из двигательного нервного окончания и эндогенно синтезируются в области нервно-мышечного синапса.
Научная новизна
Впервые показано модулирующее влияние NO, СО и H2S на освобождение медиатора из двигательного нервного окончания холоднокровных животных. Проведен анализ внутриклеточных механизмов действия NO, СО и H2S на синаптическую передачу. Показано, что повышение внутриклеточной концентрации циклических нуклеотидов (цГМФ и цАМФ) снимает ингибиторное действие NO и облегчающее действие СО на секрецию ацетилхолина. Предполагается, что изменение концентрации цАМФ под действием NO или СО опосредуется цГМФ-стимулируемой или цГМФ-ингибируемой цАМФ-специфичными фосфодиэстеразами. Показано, что в основе эффектов сероводорода на секрецию медиатора лежит увеличение внутриклеточной концентрации Са2+ за счет активации рианодиновых рецепторов эндоплазматического ретикулума. Ингибирование ферментов синтеза СО, NO и H2S приводит к эффектам противоположным действию газов. Кроме того, впервые показана экспрессия фермента синтеза СО гемоксигеназы-2 в скелетных мышечных волокнах лягушки. Также выявлена экспрессия мРНК ферментов синтеза H2S - цистатионин в-синтазы (CBS) и цистатионин г-лиазы (CSE) в диафрагмальной мышце мыши. Указанные результаты предполагают возможность эндогенного синтеза СО, NO и H2S в области нервно-мышечного синапса.
Научно-практическая ценность
Полученные в работе данные расширяют представления о модуляции синаптической передачи эндогенными физиологически активными соединениями. Это, в частности, касается вопросов о влиянии нового класса соединений - газообразных посредников, имеющих уникальные свойства, отличающие их от классических медиаторов, на функционирование нервной системы. Впервые исследованы внутриклеточные механизмы действия оксида азота, монооксида углерода и сероводорода на синаптическую функцию. Полученные экспериментальные данные могут служить основой для понимания возможных взаимодействий газообразных посредников с другими медиаторными и гормональными системами, так впервые показано, что активация как аденилат- так и гуанилатциклазных систем опосредуют эффекты NO и CO на освобождение медиатора. Научную ценность представляют данные об участии рианодиновых рецепторов эндоплазматического ретикулума в эффектах сероводорода. Особенности действия газов позволяют предположить их важную роль в формировании кратковременных и долговременных изменений в синаптических структурах, в процессах памяти и обучения. Поэтому выяснение молекулярных систем синтеза, инактивации и клеточных мишеней действия газообразных посредников позволит вести поиск и разработку фармакологических агентов, которые могут быть использованы для лечения и профилактики заболеваний, сопровождающихся нарушением синаптической функции, а также для целенаправленного синтеза новых фармакологических агентов, модулирующих работу ионных каналов нервного окончания и синаптическую передачу. Поскольку основные закономерности функционирования нервно-мышечного синапса идентичны процессам, происходящим в синапсах центральной нервной системы, результаты работы могут быть использованы также для объяснения механизмов регуляции процессов секреции нейромедиаторов и гормонов эндогенными газообразными посредниками в секреторных, нейросекреторных клетках и нейронах. Результаты исследования представляют практическую ценность для физиологов, биофизиков, биохимиков, фармакологов и нейрохимиков. Полученные данные используются при чтении лекций на кафедре физиологии человека и животных Казанского государственного университета, Казанского государственного медицинского университета, Татарского государственного гуманитарно-педагогического университета.
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ (02-04-48822, 03-04-96252, 05-04-48428, 06-04-49125); «Ведущая научная школа» (00-15-97763, НШ 1383.2003.4 НШ-4520.2006.4, НШ-3368.2008.4); АН РТ (03.-3.10.-222 (2003-2005).
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы доложены на XVIII, XIX, XX Съездах физиологического общества им. И.П. Павлова (Казань, 2001, Екатеринбург, 2004, Москва 2007), Всероссийском научном симпозиуме «Растущий организм: адаптация к физической и умственной нагрузке» (Казань, 2002, Казань 2006), Международной школе-конференции «Фармакология синаптической передачи в нервной системе» (Киев, 2002), IV, V, VI Съездах физиологов Сибири (Новосибирск, 2002, Томск, 2005, Барнаул, 2008), Международной конференции «Функциональная роль монооксида азота и пуринов» (Минск, 2001), Международной конференции по физиологии мышц и мышечной деятельности (Москва, 2003, 2005, 2006, 2007, 2008), Международном Симпозиуме «Внутриклеточная регуляция дифференциации и пластичности нейрона» (Москва, 2003), Международной конференции «Медиаторы в формировании нейрональных сетей» (Ля Сиота, Франция, 2003, 2004), I Съезде физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005), XII Международном совещании и IV Школе по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2006), Всероссийской научной конференции «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005), научной конференции «Нейроспецифические метаболиты и энзимологические основы деятельности ЦНС» (Пенза, 2006), 1 международном междисциплинарном Конгрессе "Нейронаука для медицины и психологии" (Судак, 2006), VIII региональной конференции международного общества нейробиологии беспозвоночных «Простые нервные системы» (Казань, 2006), Международной научной конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и старение» (Астрахань, 2006), Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003, 2005, 2007), Международном симпозиуме “Биологическая подвижность” (Пущино, 2004, 2006, 2008), Европейском форуме по нейронаукам FENS (Женева, Швейцария, 2008).
По теме диссертации опубликовано 57 работ.
Структура и объем диссертации
Диссертация объемом 251 страница состоит из введения, обзора литературы, изложения объектов и методов исследования, 3 глав результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 416 названий, из них 31 отечественных и 385 иностранных авторов. Диссертация содержит 48 рисунков и 4 таблицы.
ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объект исследования, использованные растворы и химические вещества. Эксперименты проводили на изолированных нервно-мышечных препаратах кожно-грудинной мышцы лягушки Rana ridibunda и диафрагмы лабораторных белых мышей. Использовали раствор Рингера для холоднокровных животных следующего состава (в мМ): NaCl - 115; KCl - 2.5; CaCl2 - 1.8; HEPES - 5 (t=20С, рН 7.2-7.4) и раствор Кребса для теплокровных животных (в мМ): NaCl - 154; KCl - 5; CaCl2 - 2; HEPES - 5, MgCl2 - 1, глюкоза - 11 (t=20С, рН 7.2-7.4). Раствор Крепса перфузировали карбогеном в течение всего эксперимента. Для устранения сокращения мышц в раствор добавляли d-тубокурарин (20-30 мкМ) или использовали раствор Рингера с пониженной концентрацией ионов кальция ([Ca2+]0) (0.2-0.4 мМ) и повышенной концентрацией ионов магния (2-4 мМ).