Базовый раствор CO готовили непосредственно перед каждым экспериментом путем насыщения 20 мл раствора Рингера в течение 30 мин газом (96%, Россия) в вытяжном шкафу. С учетом растворимости (2,691 мг на 100 г при t =230C и давлении 760 мм рт. ст.) получали раствор с концентрацией 0.96 мМ (F.Zufall, T. Leinders-Zufall, 1997). Данный раствор сразу же разводили до получения необходимой в эксперименте концентрации CO и добавляли в систему перфузии. H2S получали в реакции: Na2S+2HCl = 2NaCl + H2S, которую проводили в вытяжном шкафу (Ю.В.Карякин, И.И.Ангелов, 1974). В двугорлую колбу помещали Na2S и медленно по каплям добавляли 20% HCl, вращая колбу для равномерного перемешивания. Образовавшимся в результате реакции H2S насыщали 20 мл раствора Рингера в течение 30 мин непосредственно перед экспериментом. С учетом растворимости H2S концентрация базового раствора составляла 98 мМ (Я.И.Михайленко, 1966). Данный раствор сразу же доводили до необходимой концентрации H2S и добавляли в систему перфузии.
В качестве донора сероводорода использовали гидросульфид натрия - NaHS [K.Abe, H.Kimura, 1996]. В водных растворах NaHS диссоциирует до иона натрия (Na+) и гидросульфидного аниона (HS-), который реагирует с протоном (Н+), образуя H2S. Известно, что в физиологическом растворе одна треть H2S находится в недиссоциированной форме, а остальные две трети существуют в виде HS- (R. O.Beauhamp et al., 1984).
В экспериментах также использовали следующие фармакологические препараты фирмы Sigma: нитропруссид натрия (SNP), S-nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP), гидроксиламин солянокислый, L - аргинин, D-аргинин, NG-нитро-L-аргинин метиловый эфир (L-NAME), цинк (II) протопорфирин IX (ZnPP-IX), гидросульфид натрия (NaHS), 4-аминопиридин, L-цистеин, аминооксиацетиловая кислота (АОАК), в-цианоаланин (в-ЦА), cisN-(2-phenylcyclopentyl) azacyclotridecl-en-amine hydrochloride (MDL-12330А), 8(4-chlorophenylthio)-adenosine-3,5-cyclic monophosphat (pCPT-cAMP), 8Br-cAMP, N-2-(p-bromocinnamyl-amino)-ethyl-5-isoquinolihe sulfon-amide dihydrochloride (Н-89), 1H-[1,2,4]-oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-l-one (ODQ), 6-anilino-5,8-quinolinedione (LY-83583), 8(4-chlorophenylthio)- guanosine-3,5-cyclic monophosphat (pCPT-cGMP), 8Br-cGMP, db-cGMP, 1,4-dihydro-5-[2-propoxyphenyl]-7H-1,2,3-triazaolo[4,5-d]pyrimidine-7-one (запринаст), erytro-9-(2-hydroxy-3nonyl)-adenine) hydrochloride- (EHNA), милринон, дантролен, кофеин.
Водонерастворимые вещества растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO). Конечная концентрация DMSO в используемых растворах не превышала 0.1%. Эксперименты со светочувствительными агентами (SNP, SNAP, ZnPP-IX, дантролен) проводились в условиях низкой или нулевой освещенности.
Электрофизиологические методы. Раздражение двигательного нерва проводили прямоугольными электрическими импульсами сверхпороговой силы длительностью 0.2-0.3 мс с частотой 0.2-0.4 имп/с или пачками ритмических стимулов (500 раздражений) с частотой 10 или 50 имп/с. Регистрацию биопотенциалов производили с помощью стеклянных микроэлектродов, имеющих сопротивление 2-5 Ом. Методом внеклеточного отведения регистрировали трехфазные ответы нервного окончания и следующие за ними токи концевой пластинки (ТКП). Известно, что первая положительная фаза ответа нервного окончания представляет собой пассивный ток, генерируемый распространяющимся потенциалом действия, вторая отрицательная фаза отражает входящий Na+-ток. Третья положительная фаза отражает К+-токи через потенциалзависимые и кальцийактивируемые К+-каналы (A.Mallart, 1984; А.Л.Зефиров, И.А.Халилов, 1985). В условиях низкого содержания Ca2+ в растворе (0.2-0.4 мМ) амплитуда третьей фазы ответа нервного окончания отражает в основном величину потенциалзависимых К+-токов (А.Л.Зефиров, И.А.Халилов, 1985). Для выявления Са2+-активируемых К+-токов в стандартный раствор Рингера ([Ca2+]0 - 1.8 мМ) для холоднокровных добавляли 4-аминопиридин (100 мкМ). При добавлении в раствор 4-аминопиридина происходит блокирование потенциалзависимых К+-каналов, что ведет к увеличению длительности потенциала действия и, следовательно, большему входу Са2+ в нервное окончание. В результате выходящие Са2+-активируемые К+-токи становятся преобладающими в суммарном выходящем токе. Таким образом, амплитуда 3-й фазы ответа будет отражать величину Са2+-активируемых К+-токов (А.Л.Зефиров, И.А.Халилов, Х.С.Хамитов, 1987).
С помощью внутриклеточных микроэлектродов регистрировали ТКП и потенциалы концевой пластинки (ПКП).
Накопление, усреднение и анализ сигналов производили при помощи персонального компьютера с использованием программы «Ritm». При внеклеточном отведении ответы нервного окончания и ТКП усреднялись по 30 реализациям (при одиночном раздражении) и по 100 реализациям (при ритмическом раздражении). Проводили анализ амплитуды и квантового состава ТКП, параметров второй и третьей фазы ответа. Квантовый состав рассчитывался по методу выпадений
m = ln N0/N,
где N0 - число раздражений, N - число раздражений, не вызвавших ТКП [М.А.Каменская, 1972]. Рассчитывали также амплитуду, время роста, постоянную времени спада внутриклеточных сигналов, а также частоту миниатюрных ТКП и ПКП. Среднее значение в серии получали по результатам экспериментов на 5-12 животных. В качестве контроля (100%) принимались параметры ответов нервного окончания и токов или потенциалов концевой пластинки, квантового состава ТКП, анализируемые в каждом эксперименте до аппликации веществ. Для статистической обработки экспериментальных данных использовали параметрический t-критерий Стьюдента.
Иммуногистохимический метод Данная часть работы проведена на базе кафедры гистологии Казанского государственного медицинского университета совместно с проф. д.м.н. Р.Р. Исламовым.. Для выявления клеточной локализации гемоксигеназы-2 проводили иммуногистохимическое окрашивание непрямым иммунопероксидазным методом (R.R.Islamov et al., 2004). Для выявления гемоксигеназы-2 в скелетных мышечных волокнах использовали поликлональные антитела к гемоксигеназе-2 (OSA-200 StressGen Biotechnologies, Канада). Затем проводили иммунную реакцию с первичными антителами с помощью стрептавидин-биотинового комплекса (Elite ABC Kit; Vector Laboratories). Иммунопреципитат визуализировали с помощью диаминбензидина (DAB Substrate Kit for Peroxidase, Vector Laboratories, США). Для контроля проводили окрашивание без первичных или вторичных антител (отрицательный контроль). Готовые срезы изучали под световым микроскопом. Фотографии сделаны при помощи цифровой камеры Kodak DC120 Digital Access.
Проведение полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией Эксперименты проведены в Научно-исследовательском институте сельского хозяйства РАСХН совместно с научным сотрудником, к.б.н. С.Г. Вологином.. С помощью метода полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ ПЦР) определяли экспрессию мРНК ферметов синтеза сероводорода в диафрагмальной мышце мыши. Для выделения мРНК из образца ткани использовали лизирующий раствор следующего состава: 7.5М гуанидинизотиоцианат; 50% фенол, уравновешенный Трис-HCl (pH=7.0); 1% -меркаптоэтанол; 0.5 мкг/мл дрожжевой тРНК (Chomczynski, Sacchi, 1987). Реакцию обратной транскрипции проводили в смеси следующего состава: 0.25 мМ дезоксинуклеотидтрифосфаты (дНТФ), буфер для М-MuLV-обратной транскриптазы (50 мМ Трис-HCl), 3 мM MgCl2, 75 мМ KCl, 5 мМ дитиотреитол, 2 единицы ингибитора РНКаз (Хеликон, Россия), 1 единица М-MuLV-обратной транскриптазы (СибЭнзим, Россия), олигонуклеотиды (dT)15 (500 нг). В реакционную смесь объемом 20 мкл вносили 5 мкл препарата выделенной РНК.
ПЦР проводили в реакционной смеси следующего состава: смесь дНТФ (0.2 мМ), буфер для Taq ДНК-полимеразы (ТрисHCl, 60 мМ, MgCl2,1.5 мМ, KCl, 25 мМ, -меркаптоэтанол, 5 мМ, Тритон Х-100 (0.05%), 1 единица Taq ДНК-полимеразы (СибЭнзим, Россия), олигонуклеотидные праймеры (1 мкМ). В реакционную смесь объемом 20 мкл вносили 5 мкл препарата кДНК. Амплификацию ДНК проводили с использованием системы «Терцик MC2» (ДНК-Технология, Россия). Для реакции ПЦР нами были сконструированы ген-специфичные праймеры с использованием информация о нуклеотидной последовательности мРНК CSE и CBS, содержащаяся в базе данных GenBank (локусы NM_145953 и NM_178224). Разработанные пары праймеров получили название CSEm-f и CSEm-r, также CBSm-f и CBSm-r. Данные праймеры являются гомологами олигонуклеотидов, описанных для выявления мРНК CSE и CBS у крысы Rattus norvegicus (W.Zhao et al., 2001), и модифицированы нами с учетом нуклеотидных последовательностей мРНК выявленных для мыши [I.Ishii et al., 2004]. Нуклеотидные последовательность праймеров приведены ниже: CSEm-f - 5'-aagcagtggctgcgttg-3', CSEm-r - 5'-tgtggtgtaatcgctgcc-3', CBSm-f - 5'-agccaacttctggcaac-3', CBSm-r -5'-caccagcatatccagcttc-3'. Ожидаемый размер амплифицируемых фрагментов ДНК, ограниченных праймерами CSEm-f и CSEm-r, составил 232 пар оснований (п.о.), а для олигонуклеотидов CBSm-f и CBSm-r - 325 п.о. Вычисление оптимальных термодинамических показателей было проведено с помощью компьютерной программы «Oligo 6». На рис 1 и 2 представлены фрагменты мРНК CSE и CBS, амплифицируемые в ОТ ПЦР.
Рис. 1. Последовательность мРНК CSE, амплифицируемая в ОТ-ПЦР (232 п.о.).
В прозрачной рамке - области посадки праймеров, в заштрихованной рамке - сайт распознавания рестриктазы HaeIII (разрезание на фрагменты 39 и 193 п.о.).
Рис. 2. Последовательность мРНК CBS, амплифицируемая в ОТ-ПЦР (325 п.о.).
В прозрачной рамке - области посадки праймеров, в заштрихованной рамке - сайт распознавания рестриктазы HaeIII (разрезание на фрагменты 78 и 247 п.о.).
Для проверки специфичности реакции полученные фрагменты кДНК обрабатывали рестриктазой HaeIII (СибЭнзим, Россия) в течение 2-х часов при температуре 370С. Рестриктаза HaeIII разрезает полученные фрагменты в определенном месте (Рис.1 и 2, заштрихованный участок) с получением фрагментов известных размеров.
Детекцию результатов проводили методом горизонтального электрофореза в 2% агарозном геле, содержащим бромистый этидий (0,5 мкг/мл). Разделение проводили в трис-боратном буфере (pH 8,0). Результаты визуализировали в УФ-свете (л=310 нм). Электрофореграммы фотографировали цифровым фотоаппаратом Nikon CoolPix 4500 с оранжевым светофильтром. Для определения размеров амплифицированных фрагментов ДНК использовали маркеры молекулярных размеров (СибЭнзим, Россия).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование молекулярных механизмов действия оксида азота (II) на секрецию медиатора в двигательном нервном окончании лягушки Часть исследований, посвященных выявлению молекулярных механизмов действия NO на синаптическую функцию, проведена совместно с ассистентом кафедры физиологии человека и животных Казанского государственного университета, к.б.н. А.В.Яковлевым.
Эффекты экзогенных и эндогенных доноров оксида азота (II) на вызванную секрецию медиатора и ионные токи двигательного нервного окончания лягушки. В качестве экзогенных доноров NO использовали SNP (100 мкМ) и SNAP (250 мкМ), которые в водных растворах распадаются с образованием NO. Аппликация SNP или SNAP снижали среднюю амплитуду ТКП до 17.33.2% (n=12; р0.05) и 21.5±6.8 (n=6; р<0.05), соответственно, относительно контроля. Снижение амплитуды ТКП сопровождалось уменьшением квантового состава ТКП до 11.261.1% (n=12; р0.05) и 10.6±6.6% (n=6; p<0.05), соответственно, относительно контроля (рис. 3). На фоне действия экзогенных доноров NO происходило увеличение амплитуды 3-ей положительной фазы ответа, отражающей выходящие калиевые токи, которая возрастала до 275.013.8% (n=12; p0.05) и 196.2±10.3% (n=6; p<0.05), соответственно, от исходной величины (рис. 3). Эндогенный донор NO - гидроксиламин в концентрации 1 мМ также снижал среднюю амплитуду и квантовый состав ТКП до 57.8±5.4% и 66.8±12.0% (n=5; р<0.05), соответственно, относительно исходной величины. При этом амплитуда 3-ей фазы ответа нервного окончания увеличивалась до 146.4±2.4% (n=5; р<0.05) относительно контроля.
Таким образом, экзогенные и эндогенный доноры NO приводили к угнетению вызванного освобождения медиатора и усилению потенциалзависимого калиевого тока нервного окончания.
Исследование эффектов L-аргинина - субстрата для NO-синтазы на секрецию медиатора и ионные токи двигательного нервного окончания. NO образуется в результате окисления L-аргинина с одновременным синтезом другой аминокислоты L-цитруллина в присутствии О2 и НАДФН (Е.Б.Меньшиков и др., 2000). В нервно-мышечном препарате лягушки L-аргинин в концентрации 100 мкМ вызывал достоверное уменьшение средней амплитуды и квантового состава ТКП до 53.2±4.5% и 80.1±5.8% (n=9; р<0.05), соответственно (Рис. 4 А).
Рис. 3. Влияние донора NO - SNAP на ионные токи нервного окончания и секрецию медиатора.
А. - Усредненные ответы (30 реализаций) в контроле и после действия SNAP (250 мкМ). Эффекты SNAP показаны стрелками. Б. - Изменение амплитуды 3 фазы ответа нервного окончания (3 фаза) и квантового состава токов концевой пластинки (ТКП) (m). По оси ординат - изменение квантового состава ТКП (¦) и третьей фазы ответа нервного окончания (?) в % относительно исходных значений. [Ca2+]0 - 0.2-0.4 мМ.
При этом наблюдали увеличение амплитуды 3-ей фазы ответа нервного окончания до 112.7±3.5% (n=9; р<0.05) относительно контроля (Рис. 4 А). Эти эффекты аналогичны эффектам экзогенных и эндогенного доноров NO. Можно думать, что эффекты L-аргинина в концентрации 100 мкМ вызваны увеличением синтеза NO в нервно-мышечном синапсе. Блокирование синтеза NO с помощью неспецифического блокатора NO-синтазы L-NAME в концентрации 100 мкМ приводило к эффектам противоположным действию субстрата и доноров NO (Рис. 4 Б): амплитуда ТКП увеличивалась до 258.943.6% и квантовый состав ТКП - до 289.121.6% (n=9; р0.05) относительно контроля. При этом происходило уменьшение амплитуды 3-ей фазы ответа нервного окончания - до 81.64.4% (n=9; р0.05) относительно исходных значений. Таким образом, субстрат NO-синтазы оказывает эффекты сходные с эффектами доноров NO, а блокирование NO-синтазы - противоположные, что свидетельствует о наличие эндогенного синтеза оксида азота в области нервно-мышечного синапса.
Увеличение концентрации L-аргинина до 1000 мкМ приводило к быстрому увеличению вызванной секреции медиатора. К 20 минут перфузии квантовый состав ТКП возрастал до 1372.3±72.9% (n=5; p<0.05) относительно контроля, параметры ответа нервного окончания не изменялись. Было предположено, что L-аргинин, являясь субстратом для синтеза NO, вовлечен в механизм ингибирования NO-синтазы. Поэтому исследовали эффекты L-аргинина на фоне блокирования NO-синтазы. На фоне действия L-NAME L-аргинин в концентрации 100 мкМ не проявлял своих эффектов, а в концентрации 1000 мкМ приводил к дальнейшему увеличению квантового состава ТКП до 642.4±21.5% (n=5; p<0.05) относительно контроля, не изменяя 3-ей фазы ответа нервного окончания. Таким образом, на фоне блокирования NO-синтазы эффекты L-аргинина (1000 мкМ) на секрецию медиатора сохранялись, хотя и в меньшей степени, чем в контроле. Было предположено, что работа NO-синтазы может быть заблокирована повышением концентрации субстрата либо механизму субстрат-ферментного ингибирования, либо путем ферментативного декарбоксилирования L-аргинина в агматин, который ингибирует все изоформы NO-синтазы, либо образованием других его метаболитов (E.Galea et al., 1996).
А
Б
Рис. 4. Влияние субстрата (L-аргинин) и ингибитора NO-синтазы (L-NAME) на ионные токи нервного окончания и секрецию медиатора.
Изменения третьей фазы ответа нервного окончания (3 фаза) и квантового состава ТКП (m) при действии L-аргинина в концентрациях 100 мкМ (A) и L-NAME в концентрации 100 мкМ (Б). По оси ординат - изменение квантового состава ТКП (¦) и третьей фазы ответа нервного окончания (?) относительно исходных значений. [Ca2+]0 - 0.2-0.4 мМ.