Исследование роли гуанилатциклазной системы в эффектах СО на функцию двигательного нервного окончания. Действие СО во многих тканях реализуется путем активации гуанилатциклазы и увеличения уровня цГМФ (T.Ingi et al., 1996; F.Zufall, T.Leinders-Zufall, 1997). На фоне действия 8Br-cGMP СО не вызывал достоверных изменений амплитуды и квантового состава ТКП (Рис. 11). Для ингибирования гуанилатциклазы использовали ODQ (0.1 мкМ) и LY-83583 (30 мкМ). На фоне действия ODQ CO увеличивал квантовый состав ТКП до 144.9±3.0% (n=6; p<0.05) (Рис. 11). Сходные эффекты СО проявлял и на фоне действия LY-83583: квантовый состав ТКП повышался до 191.2±11.0% (n=5; p<0,05) относительно контроля (Рис. 11).
Таким образом, увеличение внутриклеточного уровня цГМФ полностью снимало эффект СО, тогда как на фоне ингибирования гуанилатциклазы СО увеличивал вызванное освобождение медиатора, хотя и в меньшей степени, чем в контроле. Полученные данные невозможно объяснить влиянием СO исключительно на цГМФ-зависимый механизм.
Исследование роли аденилатциклазной системы в эффектах СО. Пресинаптическая активация аденилатциклазы и последующий синтез цАМФ представляет важнейший механизм модуляции синаптической передачи. Во многих случаях кратковременная и долговременная модуляция синаптической передачи связана с активацией протеинкиназы А и последующей модификацией синаптических белков и субъединиц ионных каналов (H.Kuromi, Y.Kidokoro, 2000; C.Chen, W.G.Regehr, 1997). Было предположено, что цАМФ опосредует усиление секреции медиатора при действии экзогенного СО.
Рис. 11. Роль гуанилатциклазной системы в эффектах СО вызванную секрецию медиатора.
Изменение квантового состава ТКП на фоне действия CO (96 мкМ), СО на фоне 8Br-cGMP (100 мкМ), СО на фоне действия ингибиторов гуанилатциклазы LY-83583 (30 мкМ) и ODQ (0.1 мкМ). [Ca2+]0 - 0.2-0.4 мМ, * - p<0.05.
На фоне действия 8Вr-cAMP СО не вызывал достоверных квантового состава ТКП (Рис.12 А, В). На фоне ингибирования аденилатциклазы MDL-12330A (10 мкМ) CO также не проявлял своих эффектов (Рис. 12 Б).
Таким образом, 8Вr-cAMP имитировал действие СО, а ингибирование аденилатциклазы предотвращало эффект СО на вызванную секрецию медиатора. По-видимому, увеличение внутритерминального уровня цАМФ является основным механизмом действия СО на вызванное освобождение медиатора.
Исследование роли цГМФ-зависимых фосфодиэстераз в эффектах монооксида углерода на вызванное освобождение ацетилхолина. Эффекты СО могут быть связаны с изменением уровня внутриклеточного цАМФ в двигательном нервном окончании, посредством изменения активности цГМФ-зависимых фосфодиэстераз (ФДЭ). Аппликация СО в присутствии блокатора ФДЭ II EHNA приводила к повышению квантового состава ТКП до 266.7±19.7% (n=5; p<0.05). Как видно из Рис.13 этот эффект не отличался от эффекта СО в контрольных условиях (без предварительной аппликации EHNA).
Блокатор ФДЭ-III quazinone в концентрации 10 мкМ не приводил к достоверным изменениям вызванного освобождения медиатора. К 40 мин аппликации квантовый состав ТКП составил 81.1±26.7% (n=5, p>0.05) по отношению к контролю (Рис. 13). Последующая аппликация СО приводила к увеличению секреции медиатора, однако, эффект СО был выражен значительно меньше, чем в контрольных экспериментах. Квантовый состав повышался лишь до 139.8±11.6% (n=6, p<0.05) по отношению к уровню секреции на фоне действия quazinone (Рис. 13).
Полученные данные указывают на то, что цГМФ-ингибируемая фосфодиэстераза (ФДЭ-III) вовлечена в реализацию модулирующего эффекта СО на нервно-мышечную передачу.
Влияние ингибитора гем-оксигеназы (ZnPP-IX) на ионные токи нервного окончания и секрецию медиатора. В условиях двухэлектродной фиксации потенциалов исследовали влияние ингибитора гем-оксигеназы ZnPP на миниатюрные МТКП и ТКП в стандартном растворе Рингера ([Ca2+]0 - 1.8 мМ). Аппликация ZnPP-9 в концентрации 10 мкМ приводила к снижению частоты МТКП до 80.4±2.2% (n=6; p<0.05) относительно контроля (Рис.14 А, Б) без изменения их амплитудно-временных параметров. ZnPP-9 уменьшал также амплитуду ТКП до 83.9±4.2% (n=6; p<0.05) относительно контроля (Рис.14 В, Г). В условиях сниженной концентрации Са2+ (0.3-0.4 мМ) с использованием внеклеточной регистрации синаптических сигналов исследовали влияние ZnPP-9 на квантовый состав ТКП и ионные токи двигательного нервного окончания.
Рис. 12. Роль аденилатциклазной системы в эффектах СО на вызванное освобождение медиатора.
А - суперпозиция ответов нервного окончания и токов концевой пластинки при внеклеточной регистрации в контроле, при действии 8Вr-cAMP (100 мкМ) и СО (96 мкМ) на фоне 8Вr-cAMP (по 10 реализаций).
Б - изменение квантового состава ТКП при действии MDL-12330A (10 мкМ) СО (96 мкМ) на фоне MDL-12330A.
В - Эффекты СО (96мкМ) квантовый состав ТКП в контроле и на фоне 8Вr-цАМФ
Время аппликации веществ показано сплошной линией, [Ca2+]0 - 0.2-0.4 мМ
Рис. 13. Эффекты СО на фоне действия блокаторов цГМФ-зависимых фосфодиэстераз.
Изменения квантового состава ТКП на фоне действия СО в контроле, блокатора цГМФ-стимулируемой фосфодиэстеразы (EHNA, 50 мкМ) и ингибитора цГМФ-ингибируемой фосфодиэстеразы (quazinone, 10 мкМ) и после аппликации СО (96 мкМ) на фоне соответствующих блокаторов. [Ca2+]0 - 0.2-0.4 мМ, * - p<0.05.
Аппликация ZnPP-9 приводила к снижению усредненной амплитуды ТКП до 71.3±6.7% (n=5; p<0.05) и квантового состава ТКП до 65.46.2% (n=5; p<0.05) (Рис.15). Параметры ответа нервного окончания при действии ZnPP-9 не изменялись.
Таким образом, ингибирование гемоксигеназы приводило к эффектам, противоположным действию экзогенно апплицируемого монооксида углерода, что предполагает эндогенный синтез газа в области нервно-мышечного синапса.
Иммуногистохимическое определение гемоксигеназы-2 в скелетных мышечных волокнах. Иммуногистохимичесий метод был использован для выявления гемоксигеназы-2 в кожно-грудинной мышце лягушки с помощью поликлональных антител.
Иммунореактивность к гемоксигеназе-2 была обнаружена в экстрафузальных и интрафузальных волокнах кожно-грудинной мышцы лягушки. В миофибриллах гемоксигеназа-2 локализована в субсарколеммной области, в саркоплазматическом ретикулуме и мембране ядра (Рис. 16). В интрафузальных волокнах гемоксигеназа-2 локализована в субсарколеммной области и мембране ядра (Рис. 16). В капсуле мышечного веретена осадок
Рис. 14. Влияние ингибитора гем-оксигеназы-2 ZnPP-IX (10 мкМ) на спонтанную и вызванную секрецию медиатора
Усредненные миниатюрные токи концевой пластинки (МТКП) (А) и токи концевой пластинки (ТКП) (Б) в контроле и на фоне аппликации ZnPP-IX Изменение частоты МТКП (В) и амплитуды ТКП при действии ZnPP-IX (Г). [Ca2+]0 - 1.8 мМ, * - p<0.05.
реакции не обнаружен. Подобное распределение фермента было обнаружено также в скелетных мышечных волокнах млекопитающих (Baum et al., 2000, Kusner, 1999). Таким образом, впервые в наших исследованиях было показано присутствие СО-синтезирующего фермента в скелетных мышечных волокнах лягушки.
Таким образом, результаты наших экспериментов свидетельствуют, что монооксид углерода подобно оксиду азота II является эндогенным модулятором высвобождения медиатора в нервно-мышечном синапсе холоднокровных животных. Впервые показано, что гемоксигеназа-2 локализуется в саркоплазматическом ретикулуме скелетных мышечных волокон лягушки. Активация фермента приводит к синтезу монооксида углерода, который является относительно устойчивым и мембранопроникающим соединением. Поступая в нервное окончание в качестве ретроградного посредника, СО будет усиливать высвобождение ацетилхолина путем увеличения внутриклеточного уровня цАМФ как за счет увеличения его синтеза, так и снижения его деградации.
Рис. 15. Эффекты ZnPP-9 (10 мкМ) квантовый состав ТКП.
Изменение квантового состава ТКП при действии ZnPP-IX. Сверху - суперпозиция ответов нервного окончания и токов концевой пластинки при внеклеточной регистрации в контроле, при действии ZnPP-IX и после отмывки раствором Рингера (по 10 реализаций). [Ca2+]0 - 0.2-0.4 мМ.
Рис 16. Гемоксигеназа-2 экспрессируется в скелетных мышечных волокнах.
На рисунке представлено иммуногистохимическое окрашивание кожно-грудинной мышцы лягушки с антителами против гемоксигеназы-2.
А - При малом увеличении (15х10) показаны иммунопозитивные сайты экстрафузальных (звездочка) и интрафузальных (толстая стрелка) мышечных волокон. Б - При большом увеличении (25х10) представлена внутриклеточная локализация преципитата. Тонкие стрелки указывают на перинуклеарное и треугольник - на субсарколеммное окрашивание.
Сероводород как эндогенный модулятор освобождения медиатора из двигательного нервного окончания Исследования эффектов и механизмов действия сероводорода на нервно-мышечную передачу проводилось совместно с ассистентом кафедры физиологии человека и животных Казанского государственного университета Е.В. Герасимовой.
Влияние H2S и NaHS на секрецию медиатора и электрогенез двигательного нервного окончания лягушки. Аппликация H2S (500 мкМ) в условиях низкой внеклеточной концентрации Са2+ (0.2-0.4 мМ) (внеклеточное отведение) приводила к быстрому и обратимому увеличению амплитуды и квантового состава ТКП до 216.7±29.0% и 320.0±42.3% (n=5; р<0.05) относительно контроля (рис. 17А). Донор сероводорода - NaHS (500 мкМ) также обратимо повышал амплитуду и квантовый состав ТКП до 225.6±21.2% и 288.9±31.2% (n=5; p<0.05) (рис. 17А), соответственно. Идентичность эффектов H2S и NaHS позволила нам в дальнейших экспериментах использовать NaHS в качестве донора сероводорода. На Рис. 17 Б представлена кривая дозозависимости эффектов NaHS на квантовый состав ТКП, ЕС50=72±31 мкМ. Ни H2S, ни его донор - NaHS не вызывали изменения параметров ответа нервного окончания, что свидетельствует об отсутствии эффекта на потенциалзависимые Na2+- и К+-токи. В условиях блокирования потенциалзависимых К+-каналов 4-аминопиридином (100 мкМ) NaHS также не
А
Б
Рис. 17. Влияние H2S и NaHS на вызванную секрецию медиатора.
А - Изменение квантового состава токов концевой пластинки на фоне действия H2S (500 мкМ) и NaHS (500 мкМ) при одиночной стимуляции (Ў- H2S, ? - NaHS). На вкладке -усредненные ответы нервного окончания и следующие за ними токи концевой пластинки (30 реализаций) в контроле, при действии H2S (500 мкМ) и NaHS (500 мкМ) в отдельных экспериментах. Б - Кривая дозозависимости эффектов NaHS на квантовый состав токов концевой пластинки. [Ca2+]о =0.2-0.4 мМ.
изменял амплитуды 3-ей фазы ответа, что свидетельствует об отсутствии его влияния на кальций-активируемые калиевые токи нервного окончания. С использованием внутриклеточного отведения в условиях нормального содержания Ca2+ в растворе (1.8 мМ) анализировали влияние донора H2S на ПКП и МПКП в нервно-мышечном синапсе лягушки. Аппликация NaHS приводила к обратимому увеличению амплитуды ПКП до 125.6±8.9% (n=5; р<0.05) относительно контроля (Рис. 18 А). При этом наблюдали увеличение частоты МПКП до 253.4±46.7% (n=5; р<0.05) относительно контроля (Рис. 18 Б), без изменения амплитудно-временных характеристик сигналов.
Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что экзогенный сероводород в микромолярных концентрациях оказывает облегчающее влияние на вызванное освобождение медиатора в нервно-мышечном синапсе лягушки и его эффекты не опосредуются изменением электрогенеза нервного окончания и чувствительности постсинаптических рецепторов к ацетилхолину.
Рис. 18. Влияние NaHS (100 мкМ) на спонтанные и вызванные потенциалы концевой пластинки в нервно-мышечном синапсе лягушки.
А - Влияние NaHS на амплитуду потенциалов концевой пластинки. Сверху - усредненные потенциалы концевой пластинки (10 реализаций) в контроле и при действии NaHS (отдельный эксперимент). Б - Изменение частоты миниатюрных потенциалов концевой пластинки при действии NaHS. [Ca2+]о =1.8 мМ, * - p<0.05.
Исследование роли аденилатциклазной и гуанилатциклазной систем в эффектах H2S на секрецию медиатора в нервно-мышечном синапсе лягушки. В условиях повышенной внутриклеточной концентрации цАМФ (pCPT-cAMP, 100 мкМ) эффекты NaHS были выражены в меньшей степени, чем в контроле: квантовый состав ТКП повышался до 174.5±5.6% (n=7; р<0.05) (Рис. 19 А) по отношению к уровню секреции на фоне действия pCPT-cAMP. В условиях сниженной активности аденилатциклазы (MDL-12330А, 0.8 мкM) эффект NaHS полностью сохранялся: амплитуда ТКП к 20 минуте действия вещества повышалась до 170.135.6% (n=5; p<0.05), а квантовый состав ТКП увеличивался до 219.0±15.6% (n=5; р<0.05) (Рис. 19 Б) по отношению к уровню секреции на фоне действия MDL-12330А.
В условиях повышенной внутриклеточной концентрации цГМФ (pCPT-cGMP, 100 мкМ) эффекты NaHS были выражены в той же степени, что и в контроле - квантовый состав ТКП увеличивался до 240.1±18.9% (n=5; р<0.05) (Рис. 20). В условиях сниженной активности гуанилатциклазы (ODQ, 100 мкМ). эффект NaHS полностью сохранялся, амплитуда ТКП к 20 минуте действия вещества повышалась до 182.316.7% (n=5; p<0.05), а квантовый состав ТКП увеличивался до 224.5±9.0% (n=5; р<0.05) (Рис. 20) по отношению к уровню секреции на фоне действия ODQ.
Таким образом, эффекты сероводорода не связаны с изменением активности гуанилатциклазной системы, тогда как увеличение уровня цАМФ снимает часть эффектов сероводорода.
Рис. 19. Эффекты NaHS на вызванную секрецию медиатора в условиях увеличенной концентрации цАМФ и при ингибировании аденилатциклазы.
А - Изменение квантового состава токов концевой пластинки при действии NaHS (100 мкМ) в контроле (_) и на фоне действия аналога цАМФ - pCPT-cAMP (100 мкМ) (¦). Б - Изменение квантового состава токов концевой пластинки при действии NaHS (100 мкМ) в контроле (_) и на фоне действия ингибитора аденилатциклазы - MDL-12330 А (0.8 мкМ) (¦).Время действия вещества показано сплошной линией. [Ca2+]о =0.2-0.4 мМ.