Статья: Достижения в исследовании вируса денге: модели клеточных линий и возможности их использования

Nawa M. разработал новую клеточную линию, полученную из ткани почки монгольских песчанок (GK), предназначенную для культивирования вируса денге. Клеточную модель тестировали в двух температурных режимах (35,5 и 31 °C) с 14 штаммами вируса, включая четыре опытных образца вируса денге и десять штаммов вирусов дикого типа. Учет результатов проводили по способности образовывать бляшки и накапливать вирус в культуре клеток. На основе полученных данных показано, что образование бляшек и накопление вируса денге в культуре клеток GK зависели от температуры инкубации, лишь три штамма вируса дикого типа имели способность накапливаться и образовывать бляшки только при температуре 31 °C. По результатам накопления всех 14 протестированных штаммов вируса денге в клетках GK был в 5000 раз ниже, чем в клетках С6/36 [19].

Pervin M. et al. исследовали сыворотки подозрительных больных на инфицирование вирусом лихорадки денге с помощью заражения линии комаров рода A. aegypti и в культуре перевиваемой клеточной линии С6/36 (клеточная линия была также адаптирована к температуре 33 °С, с концентрацией клеток 4'105/мл на 25 см² в 3 мл).

Вирус идентифицировали с помощью прямого метода флуоресцирующих антител (МФА), а с использованием непрямого метода флуоресцирующих антител (НМФА) определяли серотип вируса. Из 97 положительных образцов вирус денге был выделен в 44 (45,4 %) случаев из комаров рода A. aegypti и в 24 (24,7 %) случаев в культуре клеток C6/36. Скорость выделения вируса при заражении комаров была достоверно выше, чем в перевиваемой клеточной линии. Безусловно, заражение вирусом денге комаров рода A. aegypti является более чувствительным и экономичным. Однако, по выводам авторов, серотипирование вируса более удобно проводить в культуре клеток перевиваемых клеточных линий C6/36 [22].

В 2011 г. в Бразилии из образцов сывороток, взятых от виремических больных в первый день после появления симптомов, был выделен вирус денге IV типа в культуре клеток С6/36. Циркуляция данного серотипа на этой территории ранее не была выявлена. Результаты были подтверждены с помощью НМФА и с помощью ПЦР в реальном времени [25].

Другие исследователи при поиске вируса денге в сыворотках крови больных также использовали культуру клеток комаров (TRA-284). В результате, из 17І пробы вирус был обнаружен в 56 случаев, то есть в 32,7 %. Остальные пробы были проведены через «слепой пассаж» в этой же культуре, но вирус также не был обнаружен. Однако при инкубации отрицательных сывороток в присутствии актиномицина D (ингибитор транскрипции дезоксирибонуклеиновой кислоты) 20 из 115 образцов (17,4 %) стали положительными. Эта процедура способствовала увеличению числа обнаружения вируса до 44,4 %. лихорадка денге эндемичный

На основании полученных результатов отмечено, что при добавлении актиномицина D в культуру клеток TRA-284 можно повысить процент обнаружения вируса денге в сыворотках крови человека [24].

G. Kuno с соавторами в своем исследовании сравнивали чувствительность трех клеточных линий C6/36, AP-61 и TRA-284 по признакам обнаружения, накопления и выделения вируса денге. По результатам иммунофлуоресцентного анализа, авторами были сделаны выводы о том, что при выделении вируса из сыворотки крови больного человека самым высоким титром репликации вируса была замечена в культуре клеток TRA-284, в то время, как в клеточной линии C6/36 были зафиксированы самые низкие титры в иммуно-флуоресцентном анализе, несмотря на то, что C6/36 показали лучшие результаты в области обнаружения инфицированных клеток с помощью МФА, по сравнению с другими перевиваемыми клеточными линиями.

Авторы рекомендуют использовать в лабораторных целях бессывороточную клеточную линию TRA-284, основываясь на ее высокой чувствительности при изоляции вируса денге, простоте его культивирования и экономичности процедуры [12].

С помощью культур клеток также можно изучать фенотипические характеристики вируса денге. В частности, по результатам работы Chen W.-J. et al. было установлено, что вирус денге 2-го типа при инфицировании клеток клона C6/36 имел тенденцию изменять размер бляшек в культуре при последующем пассировании вируса. Для этого клетки постоянно инфицировали в течение 20 недель. Цитопатический эффект (ЦПЭ) отсутствовал на протяжении всего срока наблюдения, однако в культуре появились гигантские клетки в 2- или 3-кратном увеличении в диаметре по сравнению с контролем. При прохождении вируса через восьмой пассаж в клетках наблюдались относительно меньшего размера бляшки, чем те, которые производит вирус первого пассажа, а при последовательном 18-м пассаже бляшки были несколько мозаичными, по сравнению с диким типом. Также авторы обнаружили, что вирусы, выделенные из пассажей 8 и 18, были более чувствительными к температурным мутациям, чем вирусы других пассажей. На основе этих данных были сделаны выводы, что некоторые вирусные частицы, проходя через последовательные пассажи, превратились в неинфекционные дефектные интерферирующие частицы [5].

Shafee N., AbuBakar S. ставили перед собой цель сравнить и охарактеризовать клеточные линии, инфицированные вирусом денге, по морфологическим изменениям и по апоптотической активности. В работе использовали популяцию клеток от трех различных хозяев C6/36 (комар), Vero (почка африканской зеленой обезьяны) и MRC-5 (фибробласт легкого человека). Инфицирование клеток проводили с помощью штамма денге 2-го типа, выделенного в Новой Гвинее.

Морфологические изменения в культуре С6/36 были замечены к 7-9-му дню эксперимента. Инфицированные клетки увеличивались в размерах и сливались с соседними участками цитоплазмы, образовывая синцитии. Морфология клеток Vero заметно изменилась: начиная с 8-го дня опыта, клеточная мембрана сокращалась и визуально наблюдалась вторая фаза деградации клетки - фаза «кровотечения» (bleeding). В клетках MRC-5 изменения происходили только к 11-му дню в виде сжатия и отделения клеток от поверхности субстрата.

Когда был определен процент антиген-положи- тельных клеток, то самое высокое значение наблюдали у C6/36 (97 %), затем у Vero (39 %) и MRC-5 (13 %). Несмотря на большое количество анти- ген-позитивных клеток в культуре С6/36, только 2 % клеток распадались на отдельные апоптозные тельца, в то время как в популяции MRC-5 20 % стали апоптотическими, а в клеточных линиях Vero наблюдали 63 %. Данные показали, что в клетках C6/36 и MRC-5 апоптоз происходит более медленно по сравнению с культурой Vero. Эти результаты позволяют предположить, что вирус денге использует разные механизмы воздействия на клетки-хозяина, а высокую инфекционность в C6/36 можно объяснить тем, что клетки имеют соответствующие рецептор(ы) для данного вируса [26].

Макрофаги играют важную роль в патогенезе денге, однако начальные клетки-мишени, запускающие вирусную инфекцию, остаются малоизученными. Поскольку вирус денге проникает в кожу человека через укусы комаров рода Aedes, Wu S. с соавторами в своем исследовании изучили репликативную способность вируса в дендритных клетках человека (в клетках Лангерганса и интерстициальных клетках).

Эксперименты, проведенные на трупных экс- плантах кожи человека, показали, что в дендритных клетках вирус денге накапливался в 10 раз быстрее в отличие от моноцитов и макрофагов человека. Наблюдения были также подтверждены гистологическими результатами кожной сыпи человека, получившего ослабленную четырехвалентную вакцину против денге. Иммуногистохический анализ клеток кожи, меченных антителом против гликопротеина оболочки вируса денге, показал, что дендритные клетки CD1a были восприимчивы к данной вирусной инфекции.

Результаты показали, что кожа человека является доступной для вируса денге и запускает дальнейший механизм передачи вируса в организм [30].

Вирус денге при проникновении в организм человека изменяет гомеостаз клеток-хозяина. Изучение взаимодействия между вирусом и клеточными белками должно обеспечить более полное понимание того, как вирус распространяется и вызывает развитие заболевания.

Pando-Robles V. с соавторами в своей работе использовали печеночную клеточную линию Huh-7. Результаты, полученные через 24 часа после заражения, показали снижение экспрессии ферментов хозяина, участвующих в гликолитическом пути, цитратном цикле и метаболизме пирувата. Это исследование предоставляет информацию об экспрессии белка вируса денге на ранних стадиях инфицирования в клетках печени хозяина [21].

Повышенный уровень сывороточной трансаминазы у пациентов с лихорадкой денге указывает на возможное влияние вирусной инфекции на функцию печени.

Для изучения действия вируса денге в клетках печени была создана модель клеточных линий, которая имитировала состояние печени у различных пациентов. В работе использовали четыре вида клеток с различным уровнем туморогенности и дифференциации клеток печени - гепатомы (HA22T, Huh7, Hep3B, и PLC) и доброкачественные гепатоциты (Chang liver). Результаты показали, что вирус денге 2-го типа одинаково хорошо прикреплялся к клеточным рецепторам всех пяти клеточных линий.

Однако более высокие темпы репликации и репродукции вириона были замечены в дифференцированных клетках (Huh7, PLC, Hep3B и Chang). Соответственно, более низкую скорость репликации наблюдали в менее дифференцированных клеточных линиях HA22T.

Дальнейшие исследования показали, что обработка бутиратом натрия (NaB, индуктор дифференцировки) усиливает репликацию вируса денге и в клетках HA22T. Авторами также было замечено, что тяжесть морфологических изменений и повышение уровня аспартатаминотрансферазы (АСТ) коррелируется со скоростью репликации вируса в инфицированных клетках гепатомы.

Эти данные были сопоставимы с клиническими результатами у 24 пациентов с лихорадкой денге, у которых в начальный лихорадочный период был отмечен повышенный уровень АСТ.

На основе полученных данных были сделаны выводы о том, что факторы, связанные с дифференцировкой клеток печени, играют важную роль в репликации вируса денге. И чем выше уровень дифференцировки клеток, тем выраженнее цитопатический эффект вируса в культуре [14].

Заключение

Наличие паспортизированных перевиваемых клеточных линий различного происхождения в условиях лаборатории дает возможность проведения широкого спектра исследований: для изоляции вируса и его культивирования в условиях in vitro, определения серотипа, для разработки диагностических и вакцинных препаратов, а также для лучшего понимания вопросов патогенеза и иммунитета вирусной инфекции благодаря значительному разнообразию возможных экспериментальных клеточных моделей.

Литера тура/references

1. О ситуации по лихорадке Денге / O situacii po lihoradke Denge [On the situation of dengue fever] [Электронный ресурс] // Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека / Federal'naja sluzhba po nadzoru v sfere zashhity prav potrebitelej i blagopoluchija cheloveka [Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Wellbeing]. URL: https://www.rospotrebnadzor.ru/about/info/news/ news_details.php?ELEMENT_ID=11165&sphrase_id=1683581.

2. О ситуации по лихорадке Денге в странах тропического и субтропического климата [Электронный ресурс] / O situacii po lihoradke Denge v stranah tropicheskogo i subtropicheskogo klimata [On the situation of Dengue fever in countries of tropical and subtropical climate] // Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека / Federal'naja sluzhba po nadzoru v sfere zashhity prav potrebitelej i blagopolu- chija cheloveka [Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Well-being]. URL: https://www. rospotrebnadzor.ru/about/info/news/news_detai ls.php?ELEMENT_ID=10900&sphrase_id=1683581.

3. Abbate T., Dewasme L., Wouwer A.V. Variable selection and parameter estimation of viral amplification in vero cell cultures dedicated to the production of a dengue vaccine // Biotechnol. Prog. - 2018. https://doi.org/10.1002/btpr.2687.

4. Alvarez M., Guzman M.G., Pupo M., Morier L., Bravo J., Rodriguez R. Study of biologic attributes of Cuban dengue 2 virus after serial passage in primary dog kidney cells // Int. J. Infect. Dis. - 2001. - № 5 (1). - P. 35-9.

5. Chen W.J., Chen S.L., Fang A.H. Phenotypic characteristics of dengue 2 virus persistently infected in a C6/36 clone of Aedes albopictus cells // Intervirol. - 1994. - № 37. - P. 25-30.

6. Grace T.D.C. Establishment of a line of mosquito (Aedes aegypti L.) cells grown in vitro // Nature Lond. - 1966. - № 211 (5047). - P. 366-367. doi: 10.1038/211366a.

7. Guzman M.G., Halstead S.B., Artsob H., et al. Dengue: a continuing global threat // Nat. Rev. Microbiol. - 2010. - Dec., № 8 (12 Suppl.). - P. 7-16. doi: 10.1038/nrmicro2460.

8. Halstead S.B., Marchette N.J. Biologic properties of dengue viruses following serial passage in primary dog kidney cells: studies at the University of Hawaii // Am. J. Trop. Med. Hyg. - 2003. - № 69 (suppl. 6). - P. 5-11.

9. Halstead S.B., Sukhavachana P., Nisalak A. Assay of mouse adapted dengue viruses in mammalian cell cultures by an interference method // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. - 1964. - Apr., № 115. - P. 1062-1068.

10. Kinney R.M., Huang C.Y.H., Rose B.C., Kroeker A.D., Dreher T.W., Iversen P.L., Stein D.A. Inhibition of dengue virus serotypes 1 to 4 in Vero cell cultures with morpholino oligomers // J. Virol. - 2005. - № 79. - P. 5116-5128.

11. Kuno G. Cultivation of mosquito cell lines in serum-free media and their effects on dengue virus replication // In Vitro. - 1983. - № 19 (9). - P. 707-713. doi: 10.1007/BF02628962/.

12. Kuno G., Gubler D.J., Velez M., Oliver A. Comparative sensitivity of three mosquito cell lines for isolation of dengue viruses // Bull. W.H.O. - 1985. - № 63. - P. 279-286.

13. Kurane I., Kontny U., Janus J., Ennis F.A. Dengue-2 virus infection of human mononuclear cell lines and establishment of persistent infections // Arch. Virol. - 1990. - № 110. - P. 91-101.

14. Lin Y.L., Liu C.C, Lei H.Y., et al. Infection of five human liver cell lines by dengue-2 virus // J. Med. Virol. - 2000. - № 60. - P. 425-431.

15. Lynn D.E. Available lepidopteran insect cell lines // Methods Mol. Biol. - 2007. - № 388. - P. 117-138. doi:10.1007/978-1 -59745-457-56.

16. Mangada M.N.M., Mohamed H., Castillo L.C., Hasebe F., Igarashi A. Effect of incubation temperature on dengue-2 viral antigen production and viral RNA synthesis in infected Aedes albopictus clone C6/36 cell line // Tissue Cult. Res. Commun. - 1995. - № 14. - P. 213-220.

17. Moi M.L., Lim C.K., Kotaki A., Takasaki T., Kurane I. Detection of higher levels of dengue viremia using FcyR- expressing BHK-21 cells than FcyR-negative cells in secondary infection but not in primary infection // J. Infect. Dis. - 2011. - № 203. - P. 1405-14. 10.1093/infdis/jir053.