Статья: Достижения в исследовании вируса денге: модели клеточных линий и возможности их использования

ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора

ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Достижения в исследовании вируса денге: модели клеточных линий и возможности их использования

Е.В. Пименова, Н.П. Храпова, Т.В. Замарина

За последние время произошло увеличение роста заболеваемости лихорадкой денге как в эндемичных, так и в неэндемичных регионах по данному заболеванию. В настоящее время мало что известно о механизме развития болезни и отдельных ее проявлений, поэтому потребность в изучении вопросов этиологии, патогенеза остается актуальной. В связи с этим был проведен анализ литературы, который показал, что для выделения, обнаружения и разработки стратегий по созданию вакцин-кандидатов против вируса денге используют клеточные линии, которые зачастую не уступают по чувствительности и рациональности методу заражения лабораторных животных. В обзоре обобщены экспериментальные данные последних лет по применению клеточных линий, используемых в качестве клеток-мишеней для изучения этиологии существования вируса денге, отмечены их преимущества и недостатки.

Ключевые слова: диагностика, клеточные линии, лихорадка денге, in vitro модель, обзор.

ADVANCES IN THE STUDY OF DENGUE VIRUS: MODELS OF CELL LINES AND THE POSSIBILITY OF THEIR USE

E.V. Pimenova, N.P. Khrapova, T.V. Zamarina

FPHI «Volgograd Research Anti-Plague Institute» of Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare;

FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

Recently the growth of dengue fever in both endemic and non-endemic regions of the disease was noticed. At present we don't know enough about the mechanism of the disease and its individual manifestations, so we need to study the issues of etiology, pathogenesis. In this regard, a literature analysis was conducted. It was shown that cell lines are used for identification, detection and development strategies for the creation of candidate vaccines against the dengue virus. The cell lines are often not inferior in sensitivity and rationality to the method of infection of laboratory animals. The review summarizes the recent experimental data about the use of cell lines as target cells to study different aspects of the dengue virus, we also noted their advantages and disadvantages.

Key words: diagnosis, cell lines, dengue fever, in vitro model, overview.

Введение

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека о ситуации по лихорадке денге в мире информирует, что в странах тропического и субтропического климата в течение последних лет сохраняется эпидемиологически неблагополучная ситуация по данному заболеванию.

Лихорадка денге распространена в ЮгоВосточной Азии (Таиланд, Индонезия, Китай, Малайзия, Япония, Вьетнам, Мьянма, Сингапур, Филиппины), Индии, Африке (Мозамбик, Судан, Египет), в тропическом и субтропическом поясе Северной, Центральной и Южной Америки (Куба, Мексика, Гондурас, Коста-Рика, Пуэрто-Рико, Панама, Бразилия и др.). В настоящее время эпидемиологическое неблагополучие регистрируют в Республике Куба, особенно в провинции Камагуэй, где было зарегистрировано 7 случаев заболевания, в том числе 3 случая с летальным исходом [2, 7].

За последние годы в РФ стали выявлять завозные случаи лихорадки денге: по данным Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека в 2012 г. было зарегистрировано 63 случая, в 2013 г. - 170, в 2014 г. - 105 случаев, в 2015 г. - 136, в 2016 г. - 145, в 2017 г. - 196 и за 5 месяцев 2018 г. - 230 случаев [1].

За последние 7 лет в РФ произошло трехкратное увеличение роста заболеваемости лихорадкой денге, хотя Россия не входит в список эндемичных регионов по данной инфекции.

Установлено, что вирус денге представлен разнообразными генетическими вариантами штаммов, которые сгруппированы в четыре антигенно отличных серотипа, каждый из которых может вызывать тяжелые заболевания и быть угрозой здоровью населения по всему миру.

На этапе лабораторной диагностики для изучения вопросов патогенеза и иммунитета, а также для последующей разработки экспериментальных образцов и получения диагностических и вакцинных препаратов против вируса денге и защиты от него используют клеточные линии различного происхождения.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Анализ данных литературных источников по различным аспектам применения клеточных линий для изучения вируса денге.

Ввиду того, что в настоящее время нет лицензированной вакцины против вируса денге, актуальным является направление по созданию стратегий в разработке эффективных вакцин-кандидатов.

Так, Muhamad M. с соавт. в своем исследовании использовали клеточную линию HepG2 для изучения ингибиторных свойств флаваноидных соединений против вируса денге 2-го типа. Результаты опытов показали, что эти соединения полностью предотвращали инфицирование клетках HepG2 вирусом в концентрации, не превышающей максимальную нетоксичную дозу, о чем свидетельствует отсутствие цитопатических эффектов в культуре клеток HepG2. При концентрации ниже максимальной нетоксической дозы соединения проявляли ингибирующую активность в отношении вируса в диапазоне от 72 до 100 %. Высокоэффективная активность флаваноидных соединений против данной инфекции свидетельствует об их потенциале в качестве противовирусного агента при разработке вакцины против вируса денге [18].

Первичные клеточные линии можно использовать для изучения генетических детерминант токсигенности вируса на молекулярном уровне. Так, Alvarez M. с соавт. изучали штамм денге (А15), выделенный из плазмы больного с неосложненной лихорадкой во время эпидемии 1981 г. на Кубе. При последовательном пассировании вируса денге в первичных клетках почки собаки (PDK) наблюдали изменения биологических признаков, таких как: образование небольших бляшек по сравнению с контролем, изменение температурных факторов (отсутствие репликации вируса при высоких температурах), снижение нейровирулентности в отношении мышей и уменьшение цитопатического эффекта в клеточных линиях LLC-MK2 и C6/36-HT, по сравнению с родительским штаммом данного вируса. На основе этих данных были сделаны выводы о возможности использования клеточных линий для получения аттенуированной вакцины [4].

Последовательное пассирование семи различных штаммов вируса лихорадки денге дикого типа в первичных клетках почки собаки (PDK) было изучено Halstead S.B. и Marchette N.J. [8]. Результаты подтвердили данные, полученные Alvarez M. et al. [4]. Культивирование в клеточных линиях PDK привело к таким же изменениям фенотипа вируса, как и в вышеназванной работе: образование более мелких бляшек, отсутствие цитопатического эффекта в культуре клеток LLC-MK2, неспособность образования бляшек в клетках Vero, температурная чувствительность и снижение вирулентности. У двух штаммов 1-го типа фенотические изменения появлялись к 15-му пассажу, у одного из двух штаммов 2-го типа - к 50-му пассажу, три штамма денге 4-го типа показали аналогичные биологические изменения в более поздних пассажах [8].

Kinney R.M. et al. изучили в культуре клеток способность ингибировать репликацию вируса денге с помощью пептид-конъюгированных фосфоро- диамидат морфолиноолигомеров (P4-PMO).

Четыре штамма вируса денге (штамм 16007 - 1-й серотип, 16681 - 2-й серотип, 16562 - 3-й серотип, 1036 - 4-й серотип) были культивированы в клетках Vero вместе с P4-PMO. Через 6 дней эксперимента наблюдали относительно небольшое подавление вируса по сравнению с контролями в присутствии двух соединений P4-PMO: 5'SL и 3'CS (нацеленных на 5'- и на 3'-концы нуклеотидного генома вируса соответственно). Дальнейшие эксперименты показали, что 5'SL и 3'Cs ингибировали репликацию вируса в зависимости от дозы и времени контакта вируса с P4-PMO в клетках-мишенях. Эти данные показывают, что дальнейшее изучение соединений 5'SL и 3'CS в качестве потенциальной терапии против вируса денге является оправданным [10].

Abbate T. et al. оценивали параметры вирусной амплификации в культуре клеток Vero и осуществляли отбор вариабельных участков РНК, предназначенных для производства вакцины против денге [3].

Многие исследователи ставили перед собой задачу изучения взаимодействия вируса денге с клетками-мишенями человека.

Так, Moi L., Lim C. et al. оценили восприимчивость перевиваемых клеточных линий (BHK клетки, экспрессирующие и не экспресирующие на своей поверхности рецепторы FcyR) к вирусу денге.

В работе были использованы 73 образца сыворотки крови, взятые у виремических больных с первичной (42 образца) и вторичной (31 образец) инфекцией. При первичной инфекции титры вируса были на одном уровне между FcyR-экспрессирующими и FcyR-не экспрессирующими клетками. При вторичной инфекции, на 1-6-й день эксперимента титры вируса были в 10 раз выше в FcyR-экспрессирующих клетках. Полученные результаты свидетельствуют о том, что основными клетками-мишенями для вирусной инфекции являются FcyR-позитивные клетки моноцитарного/макрофагального происхождения, которые могут лучше отражать фактическую виремию в условиях in vivo [17].

Kurane I. et al. исследовали восприимчивость вируса денге 2-го типа на 23 мононуклеарных клеточных линях человека, включая десять линий миеломоноцитов, восемь линий В-клеток и пять линий Т-клеток. Результаты учитывали с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания культуральной жидкости. Из всех миеломоноцитарных, В- и Т-клеточных линий самый высокий титр вируса наблюдали в культурах К 562, Jiyoye и Jurkat соответственно.

Персистирующая вирусная инфекция была отмечена в миеломоноцитарных клеточных линиях (K562), в B-клетках (Raji) и в T-клетках (HSB-2). Эти линии сохраняли высокий уровень (более 70 %) антиген-положительных клеток вируса денге 2-го типа в течение 25 недель.

Полученные результаты показали, что различные линии мононуклеарных клеток человека могут быть инфицированы вирусом денге и применяться в качестве моделей для изучения взаимодействия вируса денге с клетками человека [13].

Halstead S. et al. в своей работе изучали также восприимчивость клеток-мишеней к вирусу денге.

Анализ данных показал, что клетки BS-C-1, выделенные из почек обезьян гривет, оказались более чувствительными по сравнению с другими клеточными линиями PS, LLC MK 2 и HeLa. Также было доказано, что клеточная линия BS-C-1 по чувствительности не уступает результатам экспериментов, выполненных на мышах-сосунках с данным вирусом [9].

В тех случаях, когда нужна максимальная точность полученных результатов, используют линии клеток комаров. Доказано, что во многих случаях культуры клеток беспозвоночных более чувствительны к альфавирусам, чем культуры клеток позвоночных. В особенности это относится к первичному выделению вирусов. В настоящее время существует более 500 видов перевиваемых клеточных линий насекомых [15, 27], в том числе выделенных из основных видов переносчиков вирусной инфекции: комаров рода Anopheles, Culex и Aedes. В середине 1960-х Grace T. получил популяцию клеток из личинок комара рода Aedes aegypti, восприимчивую к вирусу денге [6]. В настоящее время данная клеточная линия A. aegypti получила название CCL-125 и ее используют в качестве идентификатора вируса денге в культуре клеток [28].

Так как вирус денге передается комарами A. aegypti, большинство исследований проводят на клеточной линии C6/36. Wikan N. с соавторами изучили возможности использования CCL-125 A. aegypti, которая первоначально была охарактеризована как линия клеток, не восприимчивая к вирусу денге. В данном исследовании было установлено, что клеточная линия CCL-125, инфицированная вирусом денге, не проявляла явного цитопатического эффекта, но ее можно использовать в качестве альтернативы клеточной линии C6/36 для изучения иммуноцитохимии и способности к бляшкообразованию вируса [28].

Влияние на репликацию вируса денге в культуре комариных клеточных линий в бессывороточ- ной среде изучал Kuno G. с соавторами. По результатам опыта были сделаны выводы, что клеточные линии A. aegypti RML-12, A. albopictus C6/36, A. pseudoscutellaris AP-61 и Tx. amboinensis TRA-171 имеют разные титры репликации вируса: от более низких в C6/36 до высоких показателей в культуре клеток RML-12. На основании этих выводов было решено, что для репликации вируса денге лучше использовать культуру клеток RML-12 [11].

Для оценки трех серотипов вируса денге Potiwat R. et al. использовал клеточную линию C6/36. Наличие вируса определяли с помощью полимеразной цепной реакции. Результаты, полученные на модели клеточных культур, дают информацию о взаимодействии патогенов с клетками хозяина, которые можно использовать для прогнозирования вспышек, а также для разработки методов обнаружения вирусов и в борьбе с переносчиками [23].

Для первичного выделения вируса лихорадки денге рекомендуют использовать культуру клеток членистоногих A. pseudoscutellaris (AP61), A. albopictus (С6/36) [29].

Согласно рекомендациям и общей практике оптимальной температурой для культивирования зараженных клеточных линий С6/36 принято считать 28 °C. Однако Mangada M. с соавторами инкубировали инфицированные клетки C6/36 вирусом денге в трех тестовых температурных режимах 28, 32 и 37 °C. Результаты показали, что продукция РНК вируса денге 2-го типа была выше в клетках и во внеклеточной жидкости, инкубированных при 32 и 37 °С, чем при 28 °С. Кроме того, было обнаружено присутствие вирусного антигена и геномной РНК на 1-2 дня раньше в культурах, инкубированных при повышенной температуре [16].

Независимо от этих данных Owens A. с соавторами культивировали в клетках Vero и C6/36 вирус денге 1-го типа в двух температурных режимах 28 и 33 °C. По результатам ИФА было показано, что титр вируса денге 1-го типа был выше в культуре клеток C6/36 при всех температурных режимах, в то время как повышение титра в клетках эпителия почки африканской зеленой мартышки (Vero) наблюдали только при температуре 33 °C. На основе этих данных авторы сделали выводы о том, что 33 °C является оптимальной температурой для выявления вируса денге в культуре клеток как млекопитающих, так и насекомых [20].