Материал: Донсков С.И., Мороков В.А. Группы крови человека. Руководство по иммуносерологии

Подобно натуральным Ko-эритроцитам искусственные Ko-клетки, полученные после обработки АЕТ, имеют выраженную экспрессию Kx-антигена (Advani [85], Branch и соавт. [111]). Искусственные Ko-эритроциты применяют для дифференцировки антител анти-Kell и анти-Kx. Для скрининга антиэритроцитарных антител, включая анти-Kell, их не используют, так как АЕТ разруша-

ет антигены системы Lutheran, Cartwright, Dombrock, LW (Landsteiner – Wiener), Knops, JMH (Jhon Milton Hagen) и другие.

Обработка эритроцитов протеолитическими ферментами по-разному сказывается на серологической активности антигенов Kell.

Ферменты растительного (папаин, фицин, бромелин) и животного происхождения (трипсин) не только не уменьшают выраженность антигенов Kell, но, напротив, существенно ее усиливают (Branch и соавт. [111], Schenkel-Brunner [341], C.И. Донсков и др. [26]).

По нашим наблюдениям [26], обработанные 0,5–1 % раствором фицина эритроциты K1 + непосредственно агглютинировались в солевой среде поликлональными сыворотками, содержащими неполные IgG анти-K1-антитела, подобно тому, как энзимированные эритроциты Rh + агглютинируются под действием неполных Rh-антител. В контрольных тестах (без обработки ферментом) неполные анти-K1-антитела не агглютинировали эритроциты K1 +.

Обработка эритроцитов трипсином в меньшей степени усиливала реакцию Kell-антител по сравнению с обработкой эритроцитов папаином.

Daniels [59], Judson и Anstee [218] отметили, что сочетанное воздействие на эритроциты смеси трипсина и α-химотрипсина или последовательная обработка эритроцитов одним ферментом, а потом другим (порядок не имеет значения) делает клетки нереактивными к антителам системы Kell. К такому же инактивирующему Kell-антигены эффекту приводит сочетанная обработка эритроцитов дитиотрейтоломипапаином,активированнымцистеином(реагентZZAP)[110,341].

Обработка эритроцитов только одним химотрипсином или только одной проназой давала различные результаты [142]. Осталось неясным, связаны ли вариации усиления или ослабления активности Kell-антигенов со свойствами использованныхантителилисоспособомиинтенсивностьюэнзимированияэритроцитов.

Parsons и соавт. [303] отметили, что некоторые моноклональные реагенты к антигенам системы Kell продолжали реагировать с энзимированными эритроцитами, утратившими способность реагировать с человеческими поликлональными антителами. Не исключено, что отдельные МКА анти-Kell могут одновременно проявлять слабую анти-Kx-активность.

Подобно большинству других мембранных белков Kell-протеин гликозилируется. Как показали Redman и соавт. [321], дегликозилирование с помощью N-гликозидазы уменьшает его мол. массу до 79–80 кДа. О-гликаназа дает слабый эффект. Эти результаты свидетельствуют о том, что углеводная составляющая Kell-гликопротеина представлена N-гликанами.

366

Структура Kell-гликопротеина

Redman и соавт. [320, 325] с помощью иммунопреципитации выделили из мембраны меченных радиоактивным йодом эритроцитов гликопротеины с мол. массой 93 кДа. Для этого авторы адсорбировали на эритроцитах антитела анти-K, анти-k, анти-Js b и анти-K22, после чего оболочку эритроцитов растворяли тритоном Х-100. Далее белковый субстрат и адсорбированные на нем антитела разделяли. Выделенные гликопротеины оказались гликопротеинами Kell, поскольку содержали Kell-антигены.АналогичныегликопротеинывыделилиWallasисоавт.[389],добавляя анти-K-антителакраствореннымтритономХ-100мембранамэритроцитовK +.

При электрофорезе редуцированного (сульфгидрированного) иммунопреципитата в полиакриламидном геле (ПААГ) Redman и соавт. наблюдали полосу, меченную радиоактивным йодом, образованную субстратом с мол. массой 93 кДа. При электрофорезе в ПААГ нередуцированного иммунопреципитата авторы получили несколько полос, образованных субстратами с мол. массой 85–90 кДа, 115–130 кДа иещеболеевысокомолекулярнымсубстратом,которыйнепроникалв7,5 %ПААГ. Вырезав каждую из этих полос и повторно подвергнув электрофорезу субстрат в редуцирующих условиях, авторы показали, что каждая полоса содержала компонент 93 кДа. Результаты эксперимента указывали на то, что белок Kell связан дисульфидными связями с другим белком, имеющим мол. массу около 40 кДа. Когда Redman и соавт. [326] установили, что белок Kx имеет мол. массу 37 кДа, было высказано мнение, что Kx ковалентно связан с белком Kell, и это вскоре было подтверждено исследованиями Parsons и соавт. [303], Jaber и соавт. [210], Khamlichi [224], которые использовали для иммунопреципитации наряду с поликлональными человеческимиантителамимоноклональныемышиныеKell-антитела.

Kell-гликопротеины отсутствовали в иммунопреципитатах из эритроцитов Ko при использовании различных поли- и моноклональных Kell-антител, в том числе антител, полученных иммунизацией мышей и кроликов очищенным Kellгликопротеином [211, 320].

Kell-антитела слабо реагировали с изолированным Kell-гликопротеином в иммуноблоттинге, хотя мышиные и кроличьи моноклональные антитела, полученные иммунизацией животных Kell-гликопротеином, выявляли гликопротеин с мол. массой 93 кДа [211, 310].

Далее было показано, что все Kell-антигены, за исключением K24, распола-

гаются на Kell-гликопротеине [210, 213, 215, 269, 307, 310].

Другой из выделенных гликопротеинов был охарактеризован как Kx-протеин. Последний тесно связан в мембране с Kell-гликопротеином и преципитируется вместе с ним в видегетеродимера [224]. Оба белка соединены дисульфидными связямичерезцистеин72,расположенныйнаKell-гликопротеинеиодновременно занимающий позицию 347 на Kx-протеине [111, 333] (см. рис. 5.1).

Marsh и Redman [268], Redman и соавт. [323] предположили, что Kell-

антигены размещаются на гликопротеине с N-гликанами, поскольку обработка Kell-гликопротеина N-гликаназой редуцировала Kell-гликопротеин до 79 кДа,

367

отщепляя от него цепь с мол. массой около 15 кДа. В то же время О-гликаназа практически не редуцировала Kell-гликопротеин.

В иммуноблоттинге K-активный гликопротеин мигрировал быстрее, чем k-активные гликопротеиновые молекулы. Считается, что первый субстрат менее гликозилирован, чем второй. Этим различием в гликозилировании объясняют более сильнуюиммуногенностьKпосравнениюсдругимиантигенамисистемыKell[141].

Carbonnet и соавт. [120, 121] отметили, что Kell-гликопротеины фосфорилируются, но не пальмитируются. Примерно 12 % массы Kell-гликопротеина составляют углеводы – N-связанные олигосахариды, размещающиеся на экстрацеллюлярной части гликопротеина [210]. O-связанные олигосахариды практически отсутствуют. Остальная часть Kell-гликопротеина представлена белком.

Структура Kell-протеина

Структура очищенного от углеводов Kell-полипептида исследована Lee и соавт. [242, 243]. Этот белок является мембранным протеином II типа, имеет мол. массу 82,8 кДа и состоит из 732 аминокислот (рис. 5.2).

Рис. 5.2. Аминокислотная последовательность Kell-протеина по Lee и соавт. [242, 243 ]. Полужирным шрифтом выделен гидрофобный участок трансмембранного домена, полу-

жирным шрифтом с подчеркиванием – участки N-гликозилирования.

Аминокислотная последовательность, обусловливающая специфичность Kellантигенов, имеет большое сходство с аминокислотной последовательностью цинксвязывающих эндопептидаз [135, 234], найденных почти у всех животных [214]. Эти эндопептидазы, широко представленные в клетках и тканях, участвуют в превращении, главным образом инактивации пептидных гормонов, таких как энцефалин, нейротензин, ангиотензин, окситоцин, брадикинин. В противоположность эндопептидазам, присутствующим во многих клетках, Kell-протеин экспрессируется только в эритроидных клетках [244], осуществляя, возможно, некое представительство цинксвязывающих эндопептидаз на эритроцитах. Не исключено, что указанное сходство обеспечивает определенные физиологические функции Kellполипептиданамембранеэритроцитов,связанныестранспортомгормонов.

Белок Kell практически повторяет аминокислотную последовательность

368

эндотелин-конвертирующего энзима 1 и 2 (ЭКЭ-1 и ЭКЭ-2) и нейтральной эн- допептидазы-24-11 (CD10). Эти белки образуют подсемейство мембранных металлопротеиназ М13. Структурная модель Kell-гликопротеина, представленная выше (см. рис. 5.1), построена на основе структурной модели ЭКЭ-1.

Kell-полипептид имеет небольшой гидрофобный внутримембранный домен, высокогидрофильный N-терминальный цитоплазматический домен, состоящий из 27–47 аминокислот, и большой С-терминальный экстрацеллюлярный домен, состоящий из 665 аминокислот.

Внеклеточная часть Kell-полипептида содержит 6 гликозилируемых участков (позиции 94, 115, 191, 345, 627 и 724), хотя считается, что аспарагин 724 не пригоден для гликозилирования на участке 6, поскольку расположенный рядом пролин 725 ингибирует гликозилирование.

В экстрацеллюлярном домене Kell-полипептида имеется 15 цистеиновых остатков, предполагающих наличие 7 дисульфидных связей, что согласуется с имеющимися данными о высокой чувствительности антигенов Kell к тиоловым реагентам (Branch и соавт. [109]). В трансмембранной области имеется дополнительный цистеиновый остаток.

Redman и Lee [322] считают, что цистеиновые остатки, располагающиеся вдоль молекулы, нужны для поддержания вторичной структуры Kell-протеина. Согласно концепции авторов, экстрацеллюлярная часть Kell-протеина состоит из двух доменов, соединенных между собой дисульфидными связями и отделяющихся один от другого длинным пептидным сегментом. Цистеиновый остаток в позиции 72 Kell-протеина обеспечивает сцепление с цистеиновым остатком в позиции 347 Kx-протеина [333], формируя таким образом Kell-иммуноген полной длины. В то же время антитела к Kell-протеину удалось получить иммунизацией кроликов коротким пептидом, состоящим из 30 аминокислот, который был синтезирован с помощью кДНК клеток костного мозга человека.

Количество K-антигена на эритроците

Jaber и соавт. [210], Hughes-Jones и Gardner [201], используя поли- и моно-

клональные анти-K-антитела, меченные радиоактивным йодом-125, подсчитали количество K-антигенных участков, приходящихся на 1 эритроцит. В зависимости от использованных реагентов число антигенных участков варьировало. Необработанныереагентывыявляли2,5–3,5тыс.копийK-антигенанаэритроцитах K +k + и 4–6,2 тыс. копий – на эритроцитах K +k −. Специфические Fab-фрагменты, выделенные из 3 моноклональных анти-K-антител, выявляли 4–8 тыс. антигенных участков, а Fab-фрагменты из 4 моноклональных антител – до 18 тыс. антигенных участков на одном эритроците [303]. От 4 до 18 тыс. K-антигенных участков на одну клетку обнаружили Merry и соавт. [281]. Авторы также использовали Fab-фрагменты моноклональных анти-K-антител, которые, очевидно, были направлены к разным эпитопам K-гликопротеина и в совокупности выявляли большее число антигенных участков, чем нативные поли- и моноклональные реагенты.

369

Не исключено также, что Fab-фрагменты, как более мелкие структурные единицы по сравнению с цельной молекулой анти-K-иммуноглобулина, легче проникают к труднодоступнымантигеннымучасткамитакимобразомвыявляютбольшееихколичество.

Таким образом, максимальное количество K-антигенных участков составляет 18 тыс. на 1 эритроцит. Для сравнения: максимальное количество hr' (с)-антигенных участков системы резус составляет 85 тыс., rh' (C)-антигенных участков – 56 тыс., Rho(D)-антигенныхучастков–31тыс.,rh″(Е)-антигенныхучастков–25тыс.наэри- троцит. По иммуногенности указанные антигены располагаются в последовательности: D > K > c > E > C, которая свидетельствует о том, что между количеством антигенныхучастковнаклеткеиихиммуногеннойактивностьюнетстрогойкорреляции.

Количество антигенов Kell (число копий на 1 клетке) может, по-видимому, зависеть от того, в какой позиции (цис или транс) наследуются гены KEL, а также от других причин общего характера, влияющих на синтез Kell-полипептида. В одной из ранних работ Allen и Lewis [87] отметили, что антиген k ослаблен в фенотипе Kk Kp(a + ), когда гены k и Kpa находятся в положении цис. Антиген K слабо выражен у лиц с фенотипом K Ge(a −), что обусловлено подавлением генного комплекса KEL генами Gerbich (эффект эпистазии).

Молекулярная основа Kell-специфичности

Серологически выявляемый полиморфизм антигенов KEL обусловлен точечными мутациями, проявляющимися в замещении отдельных аминокислот

(табл. 5.2).

Серологические различия двух основных антигенов системы Kell (K и k) обусловлены заменой T на C в экзоне 6 (строки 1 и 2 табл. 5.2). Если 193-й аминокислотный остаток Kell-гликопротеина представлен метионином (Met), то субстрат является антигеном Келл (KEL1). Если замена T на C произошла, то в 193-й позиции метионин заменяется на треонин (Thr) и субстрат приобретает серологическую специфичность антигена Челлано (KEL2).

То же самое происходит с другими антитетичными антигенами.

KEL3, KEL4 и KEL21 (группа 2 из 3-х антитетичных антигенов, строки 3, 4 и 5) отличаются мутацией в одном и том же, 281 кодоне экзона 8. KEL4 кодируется как CGG, 281-й аминокислотный остаток его представлен аргинином (Arg). KEL3 кодируется как TGG (замена C на T) и в 281 позиции происходит замена Arg на триптофан (Trp). KEL21 кодируется как CAG (замена G наAпо отношению к KEL3 и KEL4) и имеет в 281-й позиции глютамин (Glu).

Антигены третьей антитетичной пары (KEL6 и KEL7, строки 6, 7), отличаются заменой T на C в экзоне 17, в результате чего на Kell-гликопротеине в позиции 597 вместо лейцина (Leu), характерного для KEL7, прикрепляется пролин (Pro), обусловливающий специфичность KEL6.

KEL11 и KEL17 обусловлены заменой T на C в экзоне 8, приводящей к аминокислотномузамещениювалина(Val)нааланин(Ala)вкодоне302.

370