Материал: Донсков С.И., Мороков В.А. Группы крови человека. Руководство по иммуносерологии

Инструментальные методы выявления антител

История инструментальных автоматизированных методов иммуносерологического исследования начинает свой отсчет с 1960-х годов.

В 1963 г. в США McNeil и соавт. [473] предложили для определения группы крови анализатор «Техникон», применявшийся для биохимических исследований. В основу прибора положен принцип движущихся порций эритроцитов, отделенных друг от друга воздушной перемычкой, по спирально извитым пластиковым трубкам, в которые подают тестовые стандартные сыворотки. Длина трубок и скорость проталкивания образцов были рассчитаны таким образом, чтобы тестовые сыворотки успевали прореагировать с антигенами исследуемых эритроцитов. Результаты учитывали фотометрическим методом: измерением разности светопоглощения реагирующей смеси до и после реакции.

Анализатор McNeil представлял собой одноканальный прибор, что не позволяло проводить несколько исследований параллельно.

Для повышения чувствительности анализатора Sturgeon и соавт. [641] предложили предварительную обработку эритроцитов протеолитическими ферментами растительного происхождения. Наиболее эффективным для этих целей оказался бромелин – фермент, выделяемый из млечного сока стеблей ананасов.

Далее Sturgeon и соавт. [643] применили многоканальные варианты прибора, анализирующие образец крови одновременно по нескольким параметрам, что существенно расширило возможности анализатора и его пропускную способность. Авторы сконструировали 8-канальный прибор, определяющий группу крови АВО и резус.

Затем были сконструированы 10–15-канальные системы (Peoples и соавт. [518], Moore, Fernandes и соавт. [478]), что позволило автоматизировать не только определение антигенов эритроцитов АВО и резус, но и проводить реакции на сифилис (Shoeter и соавт. [610]) и австралийский антиген (Berkman и соавт. [166], Moore, Fernandes [478]).

296

Широкое применение нашел БМЦ-тест (бромелинметилцеллюлозный), который повысил чувствительность приборов при выявлении антител Rh-Hr, Lewis, Kell, Daffy.

Заметным прогрессом в развитии автоматизированных методов серологического исследования явилась предложенная Lalezari [407] методика с использованием полибрена, с помощью которой выявляли антигены и антитела системы Daffy, Kell, Kidd, МNSs в тех случаях, когда ферментная техника оказывалась неэффективной.

Протеолитические ферменты существенно активируют реакцию связывания антигенов и антител системы резус, однако, по мнению некоторых авторов, разруша-

ютантигеныKell,Daffy(Nevaulinna,Pircola[505],А.А.Рагимов,Н.Г.Дашкова[92]). Habibi и соавт. [332] применили одновременно несколько ферментных тестов: ПМЦ-тест (папаинметилцеллюлозный), ТМЦ-тест (трипсинметилцеллюлозный) и полибреновый тест, что дало возможность проводить скрининг антител различного характера с максимально широкой специфичностью, улавливать те разновидности антител, которые выявляют исключительно каким-

либо одним методом.

Более того, была автоматизирована антиглобулиновая проба Кумбса (Valeri и соавт. [675]), что создало предпосылки для внедрения оборудования, предназначенного для повседневного автоматизированного скрининга антител различной специфичности (Cotton, Ray [239], Moore [477]), в том числе аутоантител, фиксированных на эритроцитах (Gorska и соавт. [310]), а также послужило основой автоматизации пробы на индивидуальную совместимость донора и реципиента при переливании эритроцитов (Wattar и соавт. [699]).

Rowe и соавт. [586] предложили полностью автоматизированную многоканальную систему «Техникон М-16» с микропроцессорным оснащением для интерпретации результатов серологических реакций и ввели в систему сканирующее лазерное устройство, идентифицирующее исследуемые образцы крови по бар-коду. Впервые бар-код в анализаторах групп крови был применен во французских приборах «Групаматик».

Одновременно с созданием в США анализаторов групп крови «Техникон» во Франции с 1963 по 1969 год под руководством Matte [465] была разработана принципиально отличающаяся автоматизированная система «Групаматик»

(Groupamatic-50, -250, -360 соответственно на 50, 250, 360 определений в 1ч).

Вотличиеотаппаратов«Техникон»вприборах«Групаматик»былпримененкомпьютер, что обеспечило автоматическую интерпретацию результатов и вывод их на печать. Наиболее производительный вариант прибора представлял собой 12-каналь- нуюсистему,рассчитаннуюнаисследование360образцовкровив1ч(Soulier[621]).

Другое немаловажное отличие системы «Групаматик» от системы «Техникон» заключалось в способе учета результатов серологических реакций. Визуальный учет результатов в автомате был заменен оптическим способом регистрации: фотометрией жидкой части смеси и осадка (Unger, Ramgren [672]).

297

Вприборах «Групаматик» для повышения чувствительности реакции было применено центрифугирование реагирующей смеси с последующим ресуспендированием посредством встряхивания. Это важная деталь в проведении иммуносерологических реакций.

Весьма существенным также было то, что выдачу ошибочных результатов (не укладывающихся в закономерности групповой дифференцировки крови людей) прибор блокировал.

Последующее техническое усовершенствование автоматов «Групаматик» позволило увеличить объем исследований, выполняемых при апробации донорской крови, а именно: ввести исследование сыворотки крови доноров на сифилис, гепатит, а также идентифицировать дозы крови при их выдаче потребителю, что при обычном, не автоматизированном, выполнении этой процедуры было источником ошибок (Р.А. Авдеева, Л.П. Лаврова [5]).

Ваппаратах«Групаматик»успешноприменяютсятежеметоды,чтоиваппаратах «Техникон»: бромелинметилцеллюлозная техника (Garetta и соавт. [297]), трипсинполибренцитратная техника (Confida и соавт. [235]), антиглобулиновый метод (Matte [466]), реакция конглютинации в коллоидных средах (Habibi и соавт. [333]). Базовой серологической методикой приборов «Групаматик» является бромелиновая техника, обеспечивающаяоптимальноеопределениенаиболеезначимыхфактороввклинической трансфузиологии – группы крови АВО и резус-принадлежности (Haahty [330], О.К.Гавриловидр.[25],Р.А.Авдееваидр.[4,5],Л.П.Лавроваидр.[73,74]).

Приборы «Групаматик» нашли применение в США, Англии, Японии, Швеции, Австрии. По своим техническим характеристикам – пропускной способности, чувствительности реакций, надежности получаемых результатов – они выгодно отличались от других автоматов (Soustelle и соавт. [623]).

Известны модификации приборов для определения групп крови: «миниГрупаматик» (Reviel, Emblin [562]) и варианты прибора «Техникон» (Severns и соавт. [603]), позволяющие выполнять реакцию в микроплатах, что существенно сокращает расход реагентов (Descamps и соавт. [260]).

Обращает на себя внимание предложенный в 1986 г. метод агглютинации в геле [261], который представляет собой комбинацию двух методов: агглютинации и гель-фильтрации*.

Попытки создания автоматических анализаторов групп крови были предприняты и в нашей стране. В 1990 г. в Гематологическом научном центре Российский Академии медицинских наук совместно с научно-исследовательским и конструкторским институтом медицинской лабораторной техники Минмедпрома СССР

был разработан и успешно прошел лабораторные испытания первый отечественный анализатор групп крови – АГК-01 (А.Н. Алипов и др. [7], Р.С. Каландаров [63]). Прибор представлял собой полуавтоматическую систему, в которой были автоматизированы отдельные этапы реакции: разведение пробы, перемешивание

*Метод подробно описан в книге А.А. Рагимова и Н.Г. Дашковой: «Основы трансфузионной иммунологии» [91].

298

ингредиентов реакции (эритроцитов и сывороток), центрифугирование смеси, учет результатов реакции, вывод результатов на печать. Производительность прибора – 48 образцов крови в час.

Понашемумнению,реакцияагглютинацииэритроцитовкакспецифическийфе- номен–быстропротекающийпроцесс,имеющийсложныебио-физико-химические составляющие. Этот взгляд нашел подтверждение в работах Р.С. Каландарова [63], атакжедругихавторов(Wardlawисоавт.[698],В.С.Андреев[8]).

Поискновыхфизическихпринциповоценкиреакцииагглютинациипредставляет чрезвычайныйинтересдлятеорииипрактикииммуносерологическихисследований.

Впоследние годы получены интересные данные о своеобразном действии ультразвука на взвесь корпускулярных частиц (Н.Н. Князьков [65]). Ультразвук нарушает суспензионную стабильность эритроцитов и приводит к их быстрому оседанию (С.И. Донсков и др. [43], Р.С. Каландаров и др. [63, 64]).

Втечение нескольких секунд после подачи ультразвука взвесь эритроцитов расслаивается, образуются видимые агрегаты эритроцитов, которые после отключения ультразвука начинают быстро оседать на дно пробирки. Как отмечают Н.Н. Князьков [65] и Р.С. Каландаров [63], ультразвук может найти применение в анализаторах серологических реакций нового поколения.

Впоследние годы Narayanan и соавт. [503] разработали новую технологию типирования крови, основанную на спектроскопии в видимой и ультрафиолетовой части спектра. Группу крови определяют по изменению оптической плотности взвеси эритроцитов в присутствии агглютинирующих антител. Оптическая плотность ниже 665 нм соответствует отрицательному результату, выше 1000 нм – положительному. С помощью этого метода удалось с достаточно высокой степенью совпадения определять группу крови и резус-принадлежность.

Несмотрянаочевидныеуспехивразвитииавтоматизированныхсерологических методовисследования,возможностиихсовершенствованиядалеконеисчерпаны.

Идеология конструирования анализаторов серологических реакций первого поколения (приборы «Техникон», «Групаматик», «Контифло») базировалась на принципе полной автоматизации без участия оператора, чтобы исключить ошибки, связанные с так называемым человеческим фактором. Процесс определения, согласно этой идеологии, должен быть поточным (конвейерным) и по возможности универсальным, пригодным для определения максимального спектра антигенов и антител, отличающихся своими серологическими и физико-химическими характеристиками. Такое оборудование предназначалось для крупных банков крови, имеющих огромную производительность. Однако за всем этим не усматривались потребности небольших, но наиболее многочисленных, особенно для Российской Федерации, структур – отделений и кабинетов переливания крови. Их в Российской Федерации насчитывается более 1000.

Специальное малогабаритное оборудование разработанное Н.И. Васильевым [24], адаптировано для проведения пробы на индивидуальную совместимость

299

крови донора и реципиента в условиях отделения переливания крови, в непосредственной близости от постели больного.

Оценка чувствительности инструментальных методов выявления антител

Как указывают многие исследователи, вновь создаваемые методы определения антител должны быть по уровню чувствительности не ниже классической непрямой пробы Кумбса с использованием раствора низкой ионной силы (LISS) (Voak [679, 680], Bruce и соавт. [185], BCSH (Британский комитет по стандартизации в гематологии) [557], Poole и соавт. [533]).

Weisbach и соавт. [701] сравнили результаты определения антиэритроцитарных антител с помощью микрокапиллярных колонок и непрямой пробы Кумбса и нашли, что чувствительность микрокапиллярного метода в отношении клинически значимых антител несколько выше, чем непрямой реакции Кумбса. Однако авторы не могли выявить анти-Jk а-антитела обоими сравниваемыми методами в 4 из 12 случаев.

Уместно подчеркнуть, что определение антител с помощью микрокапиллярных колонок включало инкубацию реагирующей смеси в течение 15 мин, а в непрямой реакции Кумбса инкубация составляла 10 мин, что весьма существенно.

Fitzsimmons и Morel [287] установили, что увеличение времени инкубации реагирующей смеси повышает чувствительность непрямой реакции Кумбса. Дополнительные 5 мин инкубации могут быть решающими в выявлении более слабых антител.

Voak и соавт. [682] также привели данные о том, что продолжительность инкубации важна для выявления некоторых образцов слабых антител анти-Jk а, анти-Fy b и анти-K при использовании 1,5–2 % суспензии эритроцитов в растворе низкой ионной силы.

Bromilow и соавт. [183], Kretschmer и соавт. [399] считают, что тесты на ми-

крокапиллярныхколонкахDiaMed (Швейцария)чувствительнее,ноVoakисоавт. [681], Phillips и соавт. [524], Pinkerton и соавт. [527] отмечают, что этот тест не бо-

лее чувствителен, чем хорошо выполненная непрямая проба Кумбса с LISS.

На наш взгляд, возможные причины того, что методы, основанные на использовании микрокапиллярных колонок, дают лучшие результаты, чем непрямая проба Кумбса с LISS, могут заключаться, в следующем:

––микрокапиллярные гелевые технологии включают центрифугирование реагирующих ингредиентов непосредственно во время реакции, что существенно усиливает агглютинацию эритроцитов. Центрифугирование при выполнениинепрямойпробыКумбсаиспользуюттолькодляотмывания эритроцитов и это никак не сказывается на выраженности агглютинации. В то же время, если использовать центрифугирование на стадии взаимодействия сенсибилизированных эритроцитов с антиглобулиновой сывороткой, то выраженность реакции можно существенно усилить;

300