––гелевые технологии имеют объективную, независимую от оператора, автоматизированную систему учета результатов, в то время как пробирочные тесты, в том числе непрямая проба Кумбса с LISS, оценивают субъективно, и результат во многом зависит от навыков оператора.
Имеются указания на то, что чрезмерное встряхивание реагирующей смеси может искажать результаты. Исследования, проведенные в рамках совместной программы «Международного комитета стандартов в гематологии» и «Международного общества переливания крови» показали, что чрезмерное встряхивание при ресуспендировании взвеси эритроцитов является причиной ложноотрицательных результатов (Holburn [352], Voak и соавт. [684]).
Причиной искажения результатов может быть также недостаточное отмывание эритроцитов (Voak и соавт. [683]).
В 1981 г. Voak и соавт. [684] провели серию экспериментов для изучения проблем, связанных с отмыванием эритроцитов при постановке непрямой антиглобулиновой реакции. Авторы исследовали эритроциты, сенсибилизированные слабыми анти-D-антителами IgG, реагирующими с авидностью от + до ++. Для отмывания эритроцитов применяли разные солевые растворы и различные режимы центрифугирования. Установлено, что даже при использовании хорошо зарекомендовавших себя отмывающих растворов регистрируют ложные результаты.
Применение слепого метода для оценки работы персонала подтвердило, что примерно 20 % кадровых сотрудников ошибались в 5 % случаев при использовании эритроцитов, сенсибилизированных анти-D-антителами IgG, которые реагировали, как указывалось выше, с авидностью от + до ++ (Voak и соавт. [683]).
Причиной ошибочных результатов при выполнении непрямой реакции Кумбса может служить примесь антикомплементарных антител в поликлональных тестовых антиглобулиновых сыворотках. Чаще всего встречаются антитела к С3-компоненту комплемента. При инкубации свежей сыворотки, смешанной с эритроцитами, на последних может адсорбироваться комплемент, что создает видимость положительного результата.
Проблема специфичности поликлональных антиглобулиновых сывороток была в значительной мере решена, когда Международный комитет стандартов в гематологии [370] утвердил стандартные процедуры, необходимые для контроля примеси анти-С3d-антител в этих тестовых реагентах.
С целью предупреждения ошибок при учете результатов непрямой реакции Кумбса в программу обучения специалистов службы крови Англии включен слепой тест на выявление слабых антител, позволяющий проводить быстрое обучение и коррекцию любых ошибок, сопровождающих скрининг антител. Этот тест может быть использован для оценки результатов работы каждого работника. С 1987 г. он рекомендован Британским комитетом по стандартам в гематологии для специалистов-иммуносерологов госпитальных банков крови [325].
301
В 1993 г. в Англии введен национальный референтный реагент анти-D IgG для контроля методов и мастерства операторов в отношении слабой, выявляемой нередко только под микроскопом агглютинации (Phillips и соавт. [523]).
Важным этапом в стандартизации методов выявления антиэритроцитарных антител и повышения их чувствительности явилось использование автоматических ридеров для плат (Poole и соавт. [533]), а также разработка гелевых мето-
дов DiaMed (Швейцария),Auto Bio Vue (Англия), Scan Gel (Франция, США).
Гелевые методы весьма перспективны. По оценкам специалистов, набор оборудования для гелевого метода может заменить 3-4 работников, что в экономически развитых странах покрывает расходы достаточно быстро. Однако использование такого оборудования, стоимостью 150–160 тыс. долларов США, в отечественной службе крови представляется в настоящее время нерентабельным, поскольку в сравнении с отечественными методами определения групповой и резус-принадлежности крови оно на порядок дороже. Кроме того, иммуносерологам хорошо известно, что ни одна из автоматизированных систем не может выявить все существующие антитела в их многообразии.
Например, Cummins и соавт. [240] нашли, что гелевые методы DiaMed, Auto Bio Vue в ряде случаев не выявляют слабую несовместимость по системе АВО, которую выявляет простая пробирочная проба. Гелевые тесты в ряде случаев не выявляют слабые антитела анти-Fy a, анти-Jk a, анти-S, анти-K (Voak и соавт. [681], Phillips и соавт. [522, 524]).
Причиной этого является все то же центрифугирование, которое разрывает слабые агглютинаты в процессе принудительного продавливания их через плотный гель. При исследовании 100 образцов плазмы группы В(III) с эрит роцитами А2В(IV) гелевым тестом DiaMed не выявлено 68 случаев несов местимости, тестомAuto Bio Vue – 76 случаев, а 5-минутный пробирочный тест с 0,9 % NaCl –8 случаев (Phillips и соавт. [522]).
Важным компонентом при определении антител наряду с методикой являются используемые стандартные эритроциты. Результативность скрининга во многом зависит от качества эритроцитов, присутствия в них тех или иных антигенов.
Какие эритроциты рекомендуется использовать для скрининга антител? В ответе на этот вопрос нет единого мнения. Для повседневного скрининга антител используют одно-, двух- и трехклеточные панели стандартных эритроцитов, содержащие максимальное количество трансфузионно опасных антигенов: D, С, Е, c, e, K, k, Fy a, Jk a, M, N, S, s, Le a, Lu a и др.
Для идентификации антиэритроцитарных антител используют многоклеточные панели, включающие C W и Kp a (Penny) и др., в том числе редкие антигены в гомо- и гетерозиготном варианте. Такие панели требуют лаборатории с большим набором реагентов,хранилищемжидкогоазота(VoakиScott[685]).Некоторыеисследователи полагают, что в высокочувствительных методах (СканГель, DiaMed и др.) можно использовать пулированные эритроциты, полученные смешиванием нескольких гомозиготных образцов. Так, Lillevang и соавт. [442] считают, что смесь из двух образцов
302
эритроцитов не менее надежна в серологических реакциях, чем те же образцы эритроцитов, взятые раздельно. Смесь должна содержать эритроциты двух доноров, каждыйизкоторыхгомозиготенпоразнымтрансфузионноопаснымантигенам.
Eggington и соавт. [270] считают, что применение пулов эритроцитов снижает чувствительность метода, затрудняет интерпретацию результатов, уменьшает процент выявления антител. К такому же выводу пришли Bombail-Girard и со-
авт. [177], Phillips и Voak [521].
Возможность создания принципиально отличающейся системы, не связанной с прямым выявлением агглютинации эритроцитов, обсуждается в работе Narayanan и соавт. [503]. Авторы предложили новый способ учета реакции агглютинации в обычном и ультрафиолетовом свете. Эта система получила положительную оценку Министерства здравоохранения США (Poole и соавт. [533]).
Метод дает возможность объективно оценить результаты непрямой реакции Кумбса, однако ряд технических особенностей не позволяет использовать его в конвейерной работе.
Предложены 6 приемов оценки иммуносерологических методов (Voak [679], Poole и соавт. [533]).
1.Тест на чувствительность, при котором применяют заведомо слабые антитела. Применение сильных антител сглаживает картину, так как они имеют высокую авидность, поэтому их легко обнаруживают даже в больших разведениях.
2.Тест на воспроизводимость метода с использованием гетерозиготных образцов эритроцитов,сенсибилизированныхслабымиреферентныманти-D-антителами IgG.
3.Титрование антител, относящихся к разным антигенным системам эритроцитов: анти-K, анти-Fy a, анти-Jk a и др. – для установления уровня чувствительности в отношении антигенов каждой системы.
4.Пробный подбор совместимых пар донор – реципиент с применением свежих образцов сыворотки и эритроцитов. Такой подбор позволяет выявить ложноположительные результаты, обусловленные комплементом исследуемой сыворотки и антикомплементарными антителами, в основном анти-C3d, присутствующими в тестовых антиглобулиновых реагентах.
5.Сравнительные испытания (не менее 3000 тестов) в разных лечебных учреждениях. Такие испытания хорошо выявляют недостатки и слабости любых тестовых систем, обладающих разной степенью чувствительности к тем или иным антигенам и антителам.
6.Тесты с гомо- и гетерозиготной формой различных антигенов для отобра методики, которая будет хорошо работать с гетерозиготными эритроцитами.
Например, микроплатовые системы Solid Screen (Biotest) и Capture (Immuno)
не требуют использования эритроцитов, гомозиготных по данным антигенам, и лучше выявляют слабые антитела, чем системы микрокапиллярных гелевых колонок или классическая непрямая проба Кумбса (Poole и соавт. [533]).
Однако дальнейшие исследования показали, что примерно 50 % образцов эритроцитов Kk низкоавидны при выявлении антител Келл-Челлано. Это дает
303
основание беспокоиться о качестве скрининга антител, так как невозможно обеспечить гомозиготными по антигену K эритроцитами все панели для скрининга антител из-за относительной редкости гомозигот KK: 2–3 образца на 1 тыс. (Phillips, Voak [521]).
В литературе имеются сведения о создании иммуносерологических методов нового поколения, основанных на использовании антигенов эритроцитов, выделенных в чистом виде. Возможно, самая лучшая система, которая будет разработана в ближайшем обозримом будущем, позволит проводить скрининг антител с помощью биологического микрочипа, на который нанесены все известные трансфузионно опасные антигены. Над созданием подобных методов работает несколько групп ученых: одна - под руководством M. Scott в Международной референс-лаборатории групп крови (Бристоль, Англия), другая - под руководством M. Read в Центре крови Нью-Йорка. Не исключено, что уже в ближайшие годы мы можем стать свидетелями новых автоматизированных иммуноферментных методов определения клинически наиболее значимых эритроцитарных антител без использования эритроцитов (Ekins [271], Ekins, Chu [272]). Попытки создания биочипов предпринимаются и в нашей стране.
Проанализированные нами данные литературы убеждают в том, что, несмотря на большой выбор автоматизированных методик, наилучшей до настоящего времени остается непрямая проба Кумбса.
По нашему мнению, упомянутое выше малогабаритное оборудование Н.И. Васильева, специально предназначенное для проведения этой пробы, позволяет обеспечить высокое качество подбора совместимой крови для переливания реципиенту.
ДНК-типирование Rh-антигенов
Идентификация резус-принадлежности по ДНК более сложная процедура, чем ДНК-типирование групповых антигенов АВО, Lewis и др. Это можно объяснить тем, что большинство антигенных систем эритроцитов человека кодируется простыми, часто одиночными нуклеотидными заменами, встречающимися
сбольшим постоянством. Различия антигенов Rh обусловлены множественными нуклеотидными заменами и сложными перестройками в генах RHD и RHCE, поэтому, несмотря на высокую степень гомологии этих генов, трудно найти для амплификации соответствующие участки, которые отличались бы друг от друга
сдостаточным постоянством.
Наиболее контрастные отличительные признаки генов D и CE отмечены в 3'-концевом участке экзона 7 [441, 721], интроне 4 [138, 194, 615, 616], экзонах
3–7 и 9 [298, 381, 420, 452].
Определение резус-принадлежности индивида по его ДНК сводится к установлению последовательности аминокислот в указанных выше участках генов RH с помощью ПЦР. Сравнивая результаты ПЦР, полученные с испытуемым образцом ДНК и контрольными образцами, можно сделать заключение о том,
304
какому типу (D + или D −) соответствует аминокислотная последовательность исследуемого субстрата.
Генотип, определяемый по ДНК, не всегда совпадает с серологически выявляемым фенотипом. Так, D u или парциальный D-антиген, диагностированный с помощью ПЦР, может не соответствовать результатам серологических исследований, в которых они проявляют себя как обычный D. Нередко ПЦР выявляет фрагменты гена D у лиц D −, на основании чего делают вывод, что данные лица генетически являются резус-положительными, но имеют неэкспрессирующий ген D, вследствие чего серологически их идентифицируют как резус-отрицательные.
Avent и соавт. [146], Rouillac и соавт. [582] указывают, что более точные результаты удается получить с помощью двух ПЦР, направленных к разным участкам гена. Еще более точные результаты получили Gassener и соавт. [298], Legler и соавт. [420], Maaskant-van Wijk и соавт. [452] при использовании комплексной ПЦР, фокусированной на несколько экзонов, например: 3–7, 9.
Bennet и соавт. [162] выявили с помощью соответствующих олигонуклеотидных праймеров продукт из 186 пн от 3'-концевого некодирующего участка экзона 10 гена D, в то время как ген СЕ не давал продукта от этого участка экзона 10.
Volter и соавт. [721] предложили метод, основанный на установлении различий, имеющихся в экзоне 7 генов D и СЕ. Авторы сравнили продукт из 155 пн гена D и 146 пн гена СЕ. Применяя этот метод с соответствующими контролями, можно определить, является ли человек гетероили гомозиготным по гену D.
Метод, предложенный Simsek и соавт. [615], включает амплификацию интрона 4 генов D и СЕ. Продукт ПЦР, полученный от гена СЕ, составляет 1200 пн, а продукт гена D – 600 пн, так как интрон 4 гена D имеет делецию 650 пн.
Когда эти различные методы были опробованы на большом числе образцов ДНК, полученных от людей с известным фенотипом D, стало очевидно, что не все люди D − имеют делецию гена D.
Simsek и соавт. [615] выявили 3 человека с фенотипом Cde, которые типированы как D +, и 2 человека с фенотипом СсDe, типированных как D −. Авторы идентифицировали ген D по экзону 10, что дало несовпадающие результаты. Многие исследователи признают, что такие расхождения при использовании ПЦР встречаются, и что типирование антигена D по ДНК должно производиться как минимум двумя различными тестами и по разным районам гена D [146, 441, 616].
Hyland и соавт. [368] сообщили о 2 донорах с фенотипом Cde, один из которых имел фрагменты гена D, присутствующие выше 5'-участка экзона 1 и внутри 3'-некодирующего участка. Последовательности гена D, обычно расположенные между экзонами 7 и 10, у этого донора отсутствовали. У другого донора был нормальный ген D в обследованных участках.
Blunt и соавт. [174], Carritt и соавт. [194] обнаружили у 8 неродственных доноров негров с фенотипом Cde S делецию гена D, однако экзоны 8–10 присутствовали. В методе идентификации гена D с помощью ПЦР по экзону 10 такие индивиды типируются как D +.
305