Материал: Донсков С.И., Мороков В.А. Группы крови человека. Руководство по иммуносерологии

Landsteiner и Wiener [408] и усовершенствован Boorman, Dodd и Mollison [179].

В СССР метод агглютинации в солевой среде был внедрен в Центральном институте переливания крови М.А. Умновой [113] и его применяют до настоящего времени.

Метод отличается точностью и четкостью результатов, однако при его выполнении необходимо отмывать исследуемые эритроциты, готовить из них взвеси и длительно (1 ч) инкубировать взвеси с сывороткой. Перечисленные манипуляции требуют специального оснащения: термостата, центрифуги, микропробирок, что усложняет исследование и увеличивает его продолжительность.

В связи с этим усилия многих исследователей были направлены на упрощение этого метода. Однако многочисленные модификации метода солевой агглютинации, в частности капиллярные методики (Chown [215], Chown, Lewis [217, 220]), пробы с применением центрифугирования (Poole, Williams [534], Harvey [337], Majsky [455]) или выполняемые на плоскости (Wootton [723]), были по существу сведены к упрощению отдельных технических элементов. В целом же определение резус-фактора этим методом продолжает оставаться до настоящего времени относительно сложным и продолжительным лабораторным исследованием. К этому следует добавить и то обстоятельство, что сыворотки с полными антителами, необходимые для метода агглютинации в солевой среде, редко встречаются и их количество ограничено. Однако с внедрением технологий получения моноклональных антител это ограничение было снято.

Более перспективными оказались методы, включающие использование сывороток с неполными антителами. Благодаря относительной простоте и доступности тестовых сывороток они нашли широкое применение как за рубежом, так и в России.

Наибольший практический интерес из этой группы методов представляют конглютинационные пробы, основанные на использовании различных коллоидных жидкостей, которые либо добавляют к тестовой сыворотке, либо взвешивают в них исследуемые эритроциты.

Первая конглютинационная проба с применением в качестве коллоидной среды плазмы крови была предложена Diamond иAbelson [262].

В СССР аналогичный метод был разработан независимо от указанных выше авторов в Ленинградском институте переливания крови Н.И. Блиновым и Н.Д. Дробышевой [21] и впоследствии усовершенствован Т.Г. Соловьевой [104]. Этот метод, получивший название – определение резус-фактора в сывороточной среде на чашках Петри, основан на использовании эритроцитов, взвешенных в собственной сыворотке. Взвесь эритроцитов и тестовых сывороток наносят на чашку Петри, которую затем помещают в водяную баню при температуре 45–48  оС. Результат учитывают после 10-минутной инкубации взвеси по наличию или отсутствию агглютинации эритроцитов. «Чашечный» метод прост и удобен, однако его недостатком является невозможность исследования свежей цельной крови, так как в условиях указанной температуры она свертывается.

291

Для устранения этого недостатка Е.C. Копосов [67, 68] рекомендовал использовать смесь свежей цельной крови с одногруппной стандартной изогемагглютинирующей сывороткой.

А.Я. Ашкенази [13] предложила другой, более удачный, прием устранения отмеченного недостатка «чашечного» метода. Автор рекомендовала добавлять в тестовую сыворотку гепарин, что позволило определять резус-фактор свежей крови, взятой непосредственно от обследуемого. Тем не менее «чашечный» метод, так же как и другие конглютинационные пробы, основанные на использовании плазмы или сыворотки, нуждался в существенной доработке. Дело в том, что плазма и сыворотка, в которой взвешивают исследуемые эритроциты, обладают относительно низкой конглютинационной активностью, в силу чего агглютинация эритроцитов в большинстве случаев выражена недостаточно сильно. Поиски коллоидных сред с более выраженными конглютинационными свойствами привели исследователей к использованию других естественных и синтетических коллоидов.

Diamond и Denton [263] впервые отметили, что агглютинация эритроцитов выражена в значительно большой степени, если плазму, в которой они были взвешены, заменить раствором альбумина. Позднее эти данные были подтверждены, и альбумин стал широко применяться при определении резус-фактора

(Р.М. Уринсон [118], Tuck [663], Stratton [633], Lawrence [414]).

Fisk и Mc Gee [286] обратили внимание на высокие конглютинационные свойства раствора желатина и предложили использовать его в качестве коллоидной среды при определении резус-фактора и выявлении неполных резусантител. Впоследствии этот метод был модифицирован А.Г. Башлай [15] и до настоящего времени с успехом применяется во многих серологических лабораториях Российской Федерации.

О.В. Успенская [123] привела данные, свидетельствующие о том, что применение раствора желатины при определении резус-фактора позволяет сократить продолжительность этого исследования.

Grubb [324], изучая конглютинационные свойства синтетического плазмозаменителя – декстрана, показал, что титры сывороток антирезус при разведении их декстраном значительно превышают результаты титрования в изотоническом растворе натрия хлорида.

Продолжая начатые Grubb исследования, Jones [382] и Bonnel [178] установили, что декстран по сравнению с изогемагглютинирующими сыворотками и альбумином также обладает более выраженными конглютинационными свойствами.

И.И. Забалуева [54], изучив конглютинационные свойства декстрана, указала на возможность его применения в качестве стандартного разводителя, позволяющего увеличить ресурсы дефицитных сывороток антирезус. Кроме того, использование декстрана при определении резус-фактора значительно повысило демонстративность реакции (А.Я. Ашкенази [9], О.В. Успенская [123]).

292

Наряду с перечисленными коллоидами широкое применение в серологических реакциях нашел также другой синтетический плазмозаменитель – поливинилпирролидон, который не уступает по своим конглютинационным свойствам растворам декстрана (McNeil, Trentelman [474], Stroje и соавт. [637]).

Замена плазмы другими коллоидными разводителями позволила существенно улучшить качество конглютинационных методов, в частности повысить четкость результатов исследования, сократить его продолжительность.

Дальнейшее совершенствование конглютинационных проб способствовало созданию методов, пригодных для определения резус-фактора без нагревательных приборов. Интересные данные получили Eldon [273] и Drachmann [264], Они показали, что сыворотки антирезус, разведенные высокомолекулярным декстраном, приобретают способность специфически агглютинировать эритроциты в условиях комнатной температуры.

Вслед за этим были предложены методы определения резус-фактора без подогрева с использованием альбумина (Murray [499]; Hrubisko, Hrabinska [354]; Sturgeon [640]) и гепарина (А.Я. Ашкенази [13]; Daszynski [250]). Наи­ больший практический интерес представляет метод, разработанный Hrubisko и Hrabinska. При определении резус-фактора этим методом каплю тестовой сыворотки в комбинации с альбумином наносят на предметное стекло и добавляют 5–10 % взвесь эритроцитов в собственной сыворотке. Стекло оставляют на 10 мин при комнатной температуре, после чего учитывают результат.

Таким образом, применение коллоидных растворов с более выраженным, чем у плазмы, конглютинационными свойствами позволило не только сократить продолжительность определения резус-фактора и повысить четкость результатов этого исследования, но и существенно упростить его.

Нами совместно с Р.М. Уринсон и Е.А. Зотиковым [34, 49] был разработан экспресс-метод определения резус-фактора на плоскости без подогрева, основанный на использовании сывороток антирезус в комбинации с альбумином или полиглюкином. Этот метод позволил определять одновременно резус-фактор, его разновидности и группу крови. Благодаря своей простоте и доступности он широко применялся в лечебно-профилактических учреждениях России в период с 1966 г. до конца 1980-х гг., пока не уступил место еще более простым методам с использованием моноклональных антител.

Также перспективным в плане разработки более совершенных методов определения резус-фактора оказалось еще одно направление, а именно использование в серологических реакциях протеолитических ферментов.

Первые сообщения о принципе ускорения реакции антиген – антитело с помо-

щью ферментов появилось в 1946–1947 гг. (Pickles [525], Morton, Pickles [490]).

Вскоре после этого различными авторами был предложен целый ряд серологических методов выявления антигенов и антител с использованием протеолитических ферментов животного, растительного и бактериального происхождения: трипсина

(Morton,Pickles[489],Willert[718],Young[727]),папаина(Löv[449],Gilbey[303]),

293

бромелина (Pirofsky и соавт. [528], Moore и соавт. [479], Majsky [456]), протелина

(Р.С.Сахаров[95]),фицина(С.И.Донсков[36])идругихферментов.

Разработка этих методов имела большое практическое значение, так как позволила повысить чувствительность реакции. Более того, с помощью ферментов некоторым авторам удалось создать методы определения резус-фактора, не требующие нагревательных приборов (Р.С. Сахаров [95], С.И. Донсков [36]).

При определении резус-фактора методом, разработанным Hekker с соавт. [344], тестовую сыворотку, папаин, активированный солянокислым цистеином, и взвесь исследуемых эритроцитов наносят на предметное стекло и выдерживают в течение 15 мин при комнатной температуре. После этого стекло покачивают и учитывают результат. Morganti [488] и Esche [274] дали высокую оценку этому методу, подчеркивая его быстроту и наглядность результатов. То же самое можно сказать о методе, предложенномTribedi, Crosbie [662] и Р.С.Сахаровым [95].

Таким образом, была показана принципиальная возможность определения резус-фактора с помощью сывороток в сочетании с высокомолекулярными коллоидами или протеолитическими ферментами и созданы первые методы, такие же быстрые, удобные и простые как определение группы крови.

Моноклональные антирезус-антитела

Для производства моноклональных антител применяют метод гибридизации иммунных лимфоцитов (полученных от иммунизированных людей) с клетками мышиной миеломы или трансформации иммунных лимфоцитов вирусами. Вместо миеломных клеток мыши используют также лимфобластоидные клеточные линии человека. Гетеро- и аллогибридомы обладают способностью к самоподдержанию, присущей опухолевым клеткам, и одновременно способностью продуцировать антитела.Существуетнесколькоспособовгибридизациииммунныхлимфоцитов:

––прямая гибридизация, когда лимфоциты иммунизированного лица сливают с клетками миеломы в расчете, что среди слившихся клеток могут оказаться лимфобласты, продуцирующие моноклональные антитела. Этот способ менее эффективен, поскольку вероятность слияния опухолевых и антителопродуцирующих клеток очень мала; ––реиммунизация in vitro, когда перед слиянием с миеломными клетками иммунные лимфоциты выдерживают с эритроцитами, содержащими соответствующий антиген, то есть иммунизируют их вторично. Этот прием позволяет повысить концентрацию лимфобластов или лимфобластоподобных­ клеток во взвеси иммунных лимфоцитов и таким образом увеличить веро- ятностьполучениятребуемогогибрида-продуцента; ––трансформация иммунных лимфоцитов вирусом Эпштейна – Барр. Этот

способ не требует использования мышиной миеломы. Эффект превращения короткоживущих иммунных лимфоцитов в самоподдерживающуюся линию достигается тем, что встроившийся в геном клетки вирус придает ей способность к безудержной пролиферации.

294

Вирусную трансформацию лимфоцитов, придающую им опухолегенные, малигнизирующие свойства, можно рассматривать как своеобразную гибридизацию ДНК лимфоцитов и ДНК вирусов. В результате такой гибридизации лимфоциты или лимфобластоподобные клетки преодолевают апоптоз (управляемую гибель клеток) и становятся практически бессмертными.

Первые моноклональные анти-D-антитела были получены Bron и соавт. [184], Lowe и соавт. [450], Thompson и соавт. [652] и другими авторами [291, 402, 555]. Вскоре были получены антитела анти-C [651], анти-с [555, 651],

анти-E [651], анти-e [182, 292, 651], анти-G [290, 651], анти-C W [653], антиRh17, анти-Rh29 и анти-Rh46 [580, 659].

Первые в России моноклональные антитела анти-D и анти-DC получены в Центральном НИИ гематологии и переливания крови профессором И.Л. Чертковым с сотрудниками [17, 18, 31].

И.В. Дубинкиным с соавт. получены штаммы гетерогибридом человек × мышь, продуцирующие моноклональные антитела к антигенам D, c, C W, E и др., пригодныедляпромышленногопроизводствадиагностическихреагентов[51,52,53].

Для этого лимфоциты периферической крови доноров, продуцирующих соответ- ствующиеантитела,гибридизировалисклеткамимышиноймиеломыX-63иNS1.

Полученные антитела тестировали по панели стандартных эритроцитов ГНЦ РАМН (табл. 4.40). Класс иммуноглобулинов устанавливали с помощью мышиных моноклональных антител к иммуноглобулинам человека в реакции непрямой иммунофлюоресценции. Титр антител определяли посредством реакции в солевой и коллоидной среде, а также непрямой реакции Кумбса в зависимости от принадлежности антител к тому или иному классу иммуноглобулинов

(табл. 4.41).

Таблица 4.40

Протокол испытания моноклональных антител со стандартными эритроцитами

Оптимальным разводителем моноклональных антител анти-Rh, позволившим получать активные и специфичные тестовые реагенты, явились растворы с низкой ионной силой в комбинации с коллоидами полисахаридной природы. В настоящее время эти реагенты широко применяют в лечебнопрофилактических учреждениях России.

295