Материал: Донсков С.И., Мороков В.А. Группы крови человека. Руководство по иммуносерологии

животного и растительного происхождения, из которых наиболее широкое при-

менение получили трипсин (Morton и Pickles [489]); папаин (Kuhns и Bailoy [401], Berger [164], Stratton [633], Krüpe [400]); бромелин (Pirofsky, Mangum [529], Dybkjaer [268]); фицин (Unger и Katz [667], Makinodan и Maсris [457]) и

протелин (Р.С. Сахаров [95]).

Механизм усиления серологической активности полипептидов Rh под действием ферментов изучен недостаточно, хотя аминокислотная последовательность полипептидов Rh известна.

Dausset [251, 252] полагал, что ферменты вызывают специфическое изменение резус-антигена, в силу чего он приобретает способность связываться с «неполной» валентностью антитела.

Существует и другое мнение: протеолитические ферменты освобождают глубокорасположенные антигенные рецепторы. Об этом свидетельствует тот факт, что обработанные ферментом эритроциты адсорбируют повышенное количество антител (Hubinont [360]). Другим доказательством могут служить исследования Е.А. Зотикова, А.М. Уголева [59] и Е.А. Зотикова, Р.М. Уринсон [60]. Авторы установили, что обработка эритроцитов растворами трипсина и химотрипсина приводит к разрушению поверхностно расположенных антигенов.

Hughes-Jones и соавт. [365] при работе с фицином и сыворотками антирезус, меченными радиоактивным йодом, нашли, что этот фермент не открывает новых антигенных зон на поверхности эритроцитов, а повышает скорость связывания неполных антител с антигеном.

Действие различных протеолитических ферментов на эритроциты неодинаково, однако можно полагать, что оно направлено главным образом на разрушение определенных белков мембраны эритроцитов, в том числе адсорбированных на ней, которые при обычных условиях препятствуют взаимодействию резус-антигена с антителом.

Тестовые сыворотки антирезус

Первые сыворотки антирезус в России получены М.А. Умновой [113] в 1948 г. в Центральном институте переливания крови и Т.Г. Соловьевой [103, 104] в 1949 г. в Ленинградском институте переливания крови иммунизацией морских свинок и кроликов эритроцитами обезьян и человека. Однако применение гетероиммунных сывороток имело существенные недостатки. Вопервых, их приготовление было весьма затруднительно, поскольку связано с содержанием большого количества животных, их иммунизацией, заготовкой от них сывороток и последующим удалением из сывороток гетероантител. Во-вторых, гетероиммунные сыворотки не позволяли дифференцировать более тонкие различия антигенов системы резус. Было установлено, что путем иммунизации животных эритроцитами, содержащими разновидности резус-антигена – rh' (C) или rh″ (E), не удается получить сыворотки с соответствующими антителами. Кроме того, М.А. Умнова [114] отметила, что

286

гетероиммунные сыворотки проявляют панагглютинационные свойства в отношении эритроцитов новорожденных, и поэтому определить резус-фактор в этих случаях не представляется возможным.

С 1956 г., по данным Т.Г. Соловьевой [103], в нашей стране стали широко применять изоиммунные сыворотки антирезус, которые в значительной степени лишены указанных выше недостатков. Источником их получения служат резусотрицательные лица, перенесшие посттрансфузионные осложнения, связанные с переливанием резус-положительной крови, или резус-отрицательные женщины, сенсибилизированные к резус-антигену в результате беременностей.

Однако количество тестовых сывороток, получаемых из этих источников, не удовлетворяло растущей потребности лечебных учреждений в этих диагностических реактивах, а также в сырье для приготовления иммуноглобулина анти-D с целью профилактики ГБН. С начала 1960-х годов в России стали применять искусственную иммунизацию доноров, что позволило получать высокоактивные антирезусные сыворотки в достаточном количестве (Т.Г. Соловьева, М.Б. Мамедова [105], Р.М. Уринсон, С.Б. Скопина [122]).

Свойства тестовых сывороток антирезус

К общим свойствам сывороток антирезус относят их специфичность, активность и титр.

Свежезаготовленные нативные сыворотки крови в большинстве случаев вызывают неспецифическую агрегацию эритроцитов независимо от групповой и резус-принадлежности лиц, от которых они получены. В связи с этим сыворотки необходимо выдерживать до тех пор, пока они не утратят эту способность. Для изогемагглютинирующих сывороток этот срок варьирует в пределах 3 недель (Р.М. Уринсон [118]); антирезусные сыворотки утрачивают панагглютинационные свойства в течение нескольких суток.

Для устранения панагглютинационных свойств антирезусных сывороток применяли прогревание их в термостате в течение 15–20 ч (Т.Г. Соловьева) или разведение сыворотками АВ (О.В. Успенская [123], Т.Г. Соловьева [103]).

Другое свойство сывороток антирезус – их активность (авидность), характеризуется скоростью появления агглютинации эритроцитов, а также величиной агглютинатов. Для изогемагглютинирующих сывороток эти показатели относительно постоянны, за исключением случаев замедленной агглютинации эритроцитов со слабым А2-антигеном.

Активность сывороток антирезус зависит от целого ряда причин: методики использования, коллоидного разводителя, степени разведения сыворотки и др.

Титр сывороток, который также является показателем их активности, должен быть не ниже 1 : 64 [61].

Однако титр и активность сывороток не всегда взаимосвязаны. А.Я. Ашкенази [9] отмечает, что некоторые сыворотки с относительно низким титром резус-антител вызывают крупную агглютинацию эритроцитов и впол-

287

не могут быть использованы в качестве стандартных. Таким образом, при отборе сывороток в качестве тестовых решающим моментом является их авидность.

Смешивание и разведение сывороток антирезус

Смешивание и разведение сывороток в практике серологических лабораторий применяют очень широко. Это делают с целью утилизировать сыворотки с относительно низким титром антител, повысить их активность и специфичность, увеличить объем серии. Кроме того, упрощается контроль серий стандартных сывороток, полученных из нескольких небольших порций исходного сырья.

Вотношении смешивания изогемагглютинирующих сывороток мнения авторов расходятся. Так, В.Н. Краинская-Игнатова [72], Б.А. Вартапетов [23], Т.Г. Соловьева [102] считали, что при смешивании нескольких образцов сывороток конечный титр изогемагглютининов выше среднеарифметического. По данным Р.М. Уринсон [118], титр смесей не повышается и равен среднеарифметическому.

Впротивоположность этому И. Мишенин и Г. Иванихенко [81] привели данные о том, что титр смесей снижается и быстро падает в процессе их хранения.

А.А. Тарасевич [107] на основании своих исследований пришла к выводу, что при смешивании изогемагглютинирующих сывороток титр смеси может соответствовать среднеарифметическому, быть выше или ниже его.

Большинство авторов сходятся во мнении о необходимости смешивания сывороток антирезус и их разведения (Л.В. Буренкова [22], Р.М. Уринсон [119], А.Я. Ашкенази [10], Т.М. Сафронова [94], Ф.А. Траулько [109]).

Содной стороны, это позволяет повысить их активность и титр по сравнению с исходным, с другой – увеличить количество стандартной сыворотки (А.Я. Ашкенази [9]). Однако в этом есть свои особенности.

Многочисленные исследователи, применявшие для разведения сывороток антирезус плазму и сыворотку АВ(IV), отмечают, что разные образцы плазмы

исывороток АВ(IV) неодинаково активируют одну и ту же антирезусную сыворотку. Так, Spielmann [625] при титровании резус-антител в нескольких образцах изогемагглютинирующих сывороток получил разницу в титре на 4 ступени.

А.Я. Ашкенази [9, 10] отметила, что титры резус-антител при разведении сыворотки антирезус разными сериями сывороток АВ могут колебаться от 1 : 4 до

1 : 1024.

Аналогичные результаты были получены также О.В. Успенской [123] и Т.Г. Соловьевой [104].

Таким образом, конглютинационные свойства сывороток-разводителей, чаще группы АВ(IV), сильно колеблются.

Spielmann [625] связывает это с различной концентрацией белка в сыворотках. Особенно низкий титр автор получил при разведении сыворотки антирезус сывороткой больной, страдающей гипопротеинемией.

288

Однако вряд ли можно объяснить разницу в титре на 4–8 ступеней только разной концентрацией белка в сыворотках-разводителях. По-видимому, в этих случаях имеют место какие-то более тонкие механизмы, воздействующие на реакцию антиген – антитело, возможно, эндогенные ингибиторы антител.

Другая коллоидная среда – декстран – обладает более стабильными конглютинационными свойствами (П.П. Забалуева [54], Ф.А. Траулько [109], А.Я. Ашкенази [11], О.В. Успенская [123], А.Е. Скудицкий [1011]), поэтому его применяют вплоть до настоящего времени очень широко. Конглютинационная активность декстрана значительно выше, чем сывороток АВ(IV), что позволило использовать декстран для получения большого количества тестовых сывороток антирезус их разведением (Ф.А. Траулько [109], О.В. Успенская [123], С.И. Донсков [36]).

Большим достижением в прикладной иммуносерологии явились исследования Eldon [273], который установил, что сыворотки антирезус, разведенные высокомолекулярным декстраном, могут быть использованы для определения резус-фактора на плоскости при комнатной температуре. До работ Eldon иммуносерологи полагали, что резус-антитела, будучи иммунными, имеют температурный оптимум реагирования 37  оС и по определению не могут реагировать при комнатной температуре, 20–22  оС.

Дальнейшие исследования, проведенные в этом направлении Hrubicko, Hrabinska [354], С.И. Донсковым [36], показали, что определять резус-фактор и его разновидности можно при комнатной температуре, если в сыворотки антирезус добавить концентрированный раствор альбумина или полиглюкина.

Аналогичные результаты были получены Daszynski [250] и А.Я. Ашкенази [11] при использовании сывороток в комбинации с гепарином. Однако, как отмечает Daszynski, метод определения резус-фактора гепаринизированными сыворотками не достаточно чувствителен.

Таким образом, было положено начало способам приготовления тестовых сывороток, пригодных для определения резус-фактора на плоскости при комнатной температуре, и появилась перспектива разработки методов, которые позволяли объединить определение группы крови и резус-фактора в один процесс [36].

Методы определения Rh-антигенов и Rh-антител

Для определения антигенов и антител системы резус известен целый ряд различных методов (табл. 4.39). Все методы с их многочисленными модификациями можно разделить на 2 большие группы: методы, включающие использование тестовых сывороток с полными антителами и основанные на применении сывороток, содержащих неполные резус-антитела.

289

Таблица 4.39

Методы определения антигенов и антител системы резус

Реакция солевой агглютинации (Landsteiner, Wiener [408])

Конглютинационные пробы

•на чашках Петри (Блинов Н.И., Дробышева Н.С. [21])

•на подносах (Успенская О.В. [123])

•в пробирках с желатином (Башлай А.Г. [14])

•в пробирках с 33 % полиглюкином (Михайлова А.А. [79])

•с гепарином (Ашкенази А.Я. [9])

•с композитом коллоидов (Траулько Ф.А. [109])

•экспресс-метод на плоскости (Донсков С.И. [36])

Ферментные методы

•с фицином (Донсков С.И. [36])

•с протелином (Сахаров Р.С. [95])

•с трипсином (Dausset, Widal [253])

Антиглобулиновые пробы

•непрямая проба Кумбса (Coombs, Mourant, Race [238])

•двойной Кумбс (Зотиков Е.А. и др.)

•Кумбс-фермент (Unger и Katz [667])

•адсорбция – элюция (Weiner [700])

•потребление антиглобулина

Карточки для определения групп крови (Элдон [273]) (Донсков С.И. [36])

Инструментальные методы

•Групаматик (Франция)

•Техникон (США)

•Контифло (Румыния)

•АГК-01 (Алипов А.Н. и др. [7])

•гелевые технологии ДиаМед (Швейцария),

ОртоБайоВью (Англия), Скангель, Биорад (Франция) Медиком, GRIFOLS (Испания)

Молекулярно-биологические методы

•полимеразная цепная реакция

•Саузерн-блот

Вторая, наиболее многочисленная, группа методов может быть подразделена на 3 подгруппы: конглютинационные, антиглобулиновые и ферментные.

Вкачестве самостоятельной группы следует выделить методы с использованием специальных карточек с высушенными на них тестовыми реактивами. Перед исследованием высушенные реагенты растворяют каплями воды и проводят определение как на плоскости.

Отдельные группы составляют инструментальные методы – анализаторы групп крови, а также молекулярно-биологические технологии.

По оснащению и технике выполнения методы можно разделить на пробирочные, капиллярные и выполняемые на плоскости.

Впервые годы после открытия резус-фактора его определяли с помощью агглютинации в солевой среде, основанной на использовании сывороток, содержащих полные антирезус-антитела. Этот метод был разработан в 1941 г.

290