Материал: Донсков С.И., Мороков В.А. Группы крови человека. Руководство по иммуносерологии

рованных эритроцитов со специфическими антимышиными сыворотками, меченными флюоресцеинизотиоцианатом «Sigma». Реакцию учитывали на флюоресцентном микроскопе «Opton». Иммуносерологические параметры моноклональных антител определяли с помощью общепринятых серологических методов: реакции агглютинации в солевой и коллоидной среде, непрямой пробы Кумбса.

Образцы моноклональных антител титровали до и после адсорбции эритроци-

тами А(II), В(III) и О(I).

Адсорбцию антител проводили при комнатной температуре 20–22  оС в течение 1 часа в соотношении 2 объема сыворотки + 1 объем плотно упакованного гомогенизированного осадка трижды отмытых эритроцитов.

Элюцию антител выполняли по методике, описанной Wiener [232], Feng и соавт. [102]: осадок трижды отмытых сенсибилизированных эритроцитов замораживали, затем оттаивали и добавляли к нему 50 % этиловый спирт в соотношении 1 : 9. Смесь вновь замораживали, оттаивали и отмывали дистиллированной водой. К полученномуосадкустромысенсибилизированныхэритроцитовдобавлялиравныйобъем0,15М NaClиинкубировалипритемпературе37 оС1ч,далеесмесьцентрифугировали,полученную надосадочную жидкость (элюат) испытывали на специфичность и активность.

Устойчивость антител к унитиолу (2,3 димеркаптопропансульфонат натрия – CH2SH-CH-SH-CH2SO3Na) оценивали посредством титрования сыворотки после добавления равного объема 1,25 % раствора этого реактива и инкубации полученной смеси в течение 2 ч при температуре 37  оС.

Нейтрализацию антител производили водорастворимыми группоспецифическими субстанциями, фруглюмином А и В, выделенным из желудка свиней и лошадей (производства Белорусского НИИГПК), из расчета 1 мг сухого фруглюмина на 1 мл МКА.

Из полученных гибридом отобрали 8 продуцирующих МКА анти-АВ. Серии 1–7 МКА анти-АВ получили при иммунизации эритроцитами А(II), серию 8 МКА антиАВ – эритроцитами B(III). Все серии антител агглютинировали эритроциты А1(II), А2(II)иВ(III)инереагировалисэритроцитамиО(I).ТитрМКАанти-АВсэритроци-

тамиА1соответствовал1 : 16–1:128,сэритроцитамиB(III)–1 : 8–1:64(табл. 3.8).

Таблица 3.8

Протокол перекрестной адсорбции МКА анти-АВ, полученных при иммунизации мышей эритроцитами А(II) и B(Ш)

86

Обращал на себя внимание тот факт, что титр МКА анти-АВ (серии 1–7), полученных иммунизацией животных эритроцитами A(II), был на 1–3 ступени выше с эритроцитамиA(II), чем с эритроцитами B(III). Титр МКА анти-АВ (серия 8), полученных иммунизацией животных эритроцитами B(III), был на 2 ступени выше с эритроцитами B(III), чем с эритроцитамиA(II).

При адсорбции МКА анти-АВ серий 1–7 эритроцитами A(II) активность антител полностью (до нуля) снижалась как в отношении эритроцитов A(II), так и эритроцитов B(III). Образец МКА анти-АВ серии 8 после адсорбции эритроцитами A(II) сохранил способность агглютинировать эритроциты B(III) в разведении 1 : 4, полностью утратив активность в отношении эритроцитовA(II).

При адсорбции МКА анти-АВ серий 1–7 эритроцитами B(III) активность антител убывала в отношении эритроцитов B(III), однако в отношении эритроцитов A(II) сохранялась в разведении 1 : 2–1 : 4. Образец МКА анти-АВ серии 8 после адсорбции эритроцитами B(III) утратил активность как в отношении эритроцитов B(III), так иA(II). Титр МКА анти-АВ после адсорбции эритроцитами О(I) не изменился и соответствовал исходному.

Элюаты, снятые с эритроцитов A(II), реагировали с одинаковой авидностью с эритроцитами A(II) и B(III). Элюаты, полученные с эритроцитов B(III), сильнее реагировали с эритроцитами A(II), слабее – с эритроцитами B(III). И в первом, и во втором случаях агглютинация была хорошо выражена.

Полученные данные позволили заключить, что МКА анти-АВ серий 1–7 содержали комбинированные антитела со специфичностью анти-АВ и анти-А, МКА анти-АВ серии 8 – анти-АВ и анти-В.

После инкубации с унитиолом испытуемые антитела не утрачивали активности, что указывало на их принадлежность к классу IgG. Об этом также свидетельствовали эксперименты с флюоресцирующими антимышиными анти-IgG- сыворотками, которые специфически реагировали с эритроцитами, нагруженными субагглютинирующей дозой МКА анти-АВ.

При температуре 6–8  оС МКА анти-АВ проявляли более высокую активность (титр от 1 : 8 до 1 : 128). При температуре 40–45  оС, так же, как и при температуре 20–25  оС, активность антител была ниже (титр от 1 : 4 до 1 : 64). В отличие от клас- сическихтермостабильныхиммунныхантителIgG(например,анти-D,аллоиммун- ныхα,βидр.)полученныеМКАанти-АВоказалисьтермолабильными.Послепро- гревания при температуре 70  оС они полностью утрачивали активность. Уместно упомянуть, что естественные перекрестно реагирующие антитела, содержащиеся в сывороткахОαβ(I),такжеотносятсяккатегориитермолабильных.

Вопреки ожиданиям все полученные серии МКА-АВ легко нейтрализовались группоспецифическими субстанциями – фруглюмином А и В, хотя, как известно, группоспецифические субстанции нейтрализуют только естественные IgM изогемагглютинины α и β, но не разрушают иммунные IgG α- и β-антитела. Это свойство естественных и иммунных антител используют для их идентификации. То обстоятельство, что МКА анти-АВ, будучи иммунными

87

IgG, нейтрализовались группоспецифическими субстанциями, существенно отличает их от классических иммунных антител и позволяет выделить их в особую группу – иммунные IgG-антитела термолабильные легко нейтрализуемые. К этой же группе могут быть отнесены перекрестно реагирующие антитела лиц О(I), имеющие идентичную иммуносерологическую характеристику – IgG термолабильные. Их происхождение (иммунное или естественное) остается неясным. Не исключено, что они так же, как МКА анти-АВ, являются иммунными.

Обработка эритроцитов B(III) протеолитическими ферментами, специфически разрушающими антиген В, лишала эритроциты групповых свойств. После такой обработки эритроциты B(III) в отличие от обработанных глутаровым альдегидом приобретали свойства эритроцитов О(I) группы и не агглютинировались сыворотками анти-В. Одновременно исчезала их способность взаимодействовать с перекрестно реагирующими антителами МКА анти-АВ, а также перекрестно реагирующими антителами лиц О(I).

По характеру реагирования полученные МКА анти-АВ вряд ли можно отнести к анти-А и анти-В. По-видимому, это одно, маскирующееся под анти-А и анти-В антитело, реагирующее с общей для эритроцитов А(II) и В(III) антигенной детерминантой. По своим свойствам эти антитела близки к перекрестно реагирующим антителам сывороток лиц О(I), описанным выше. Сам факт получения антител анти-АВ в ответ на иммунизацию эритроцитами какA, так и B служит веским аргументом в пользу того, что оба антигена наряду с существенными серологическими различиями имеют идентичный эпитоп С, в равной мере являющийся сильным иммуногеном.

Таким образом, имеются все основания полагать, что групповая система АВО представлена не двумя агглютиногенами – А, В и двумя агглютининами – α, β, а тремя агглютиногенами – А, В, С и тремя агглютининами – α, β и С.

Антиген С выявляют с помощью перекрестно реагирующих сывороток лиц Оαβ(I) [184, 229]. Именно фракция перекрестно реагирующих агглютининов представляет собой антитела анти-С. Последние можно удалить из сыворотки указанных лиц адсорбцией как А, так и В эритроцитами. При рутинном исследовании антиген С маскируется присутствием антигена А и / или В. Антитела анти-С в обычных методах исследования проявляют себя подобно несепарируемой комбинации α- и β-агглютининов. У лиц, имеющих группу крови А и В, агглютинины анти-С отсутствуют.

Не исключено, что антитела анти-С могут встречаться в чистом виде. Однако отличить их от анти-А и анти-В обычными методами не представляется возможным. У плодов O(I) от матерей O(I) находят антитела со свойствами анти-С, у плодов А(II) и В(III) от матерей А(II) и В(III) таких антител не находят.

Owen (цит. по Wiener [229]) получил чистую фракцию анти-С-агглютининов адсорбцией сывороток Оαβ(I) эритроцитами опоссума и кролика, которые, содержат парциальный антиген В и, по-видимому, не содержат антигена С. После такой обработки оставшиеся в сыворотке антитела анти-С реагировали

88

с эритроцитами А и В, и их можно было удалить эритроцитами А или В в адсорбционной пробе. Однако для окончательного доказательства того, что С-, α- и β-агглютинины являются самостоятельными независимыми друг от друга антителами, не достает эксперимента, в котором антигены А и В были бы разрушены ферментативно (не реагировали бы с сыворотками анти-А и анти-В), но при этом сохранили бы антиген С (продолжали бы агглютинироваться анти-С- сывороткой или элюатом αβ). Только в том случае, если эритроциты не агглютинируются α и β, но продолжают агглютинироваться анти-С-антителами, можно не только с достаточной степенью уверенности констатировать существование антигена С, но и с помощью такого реактива изучить закономерности наследования этого антигена, возможные его разновидности и комбинации. В наших экспериментах ферментативное разрушение В-антигена приводило одновременно к утрате их способности реагировать с МКА анти-АВ. Иными словами разрушение В-антигена влекло за собой разрушение антигена С. Однако, несмотря на отрицательный результат этого эксперимента, полученные нами данные в целом со всей очевидностью свидетельствуют о наличии третьего антигена в системе АВО, существование которого блестяще предсказал Wiener.

Подгруппы крови

А2 и А2В

Эритроциты A(II) с пониженными агглютинационными свойствами впервые описали Dungern и Hirszfeld в 1911 г. [94].

Landsteiner и Levine [133] подразделили фенотип А на подгруппы А1 и А2. Около 88 % лиц группы А относятся к подгруппе А1, 12 % – к подгруппе А2. Среди лиц AB(IV) 80 % А1В, 20 % А2В. Ранее полагали, что лица А1 имеют антигены А и А1, а лица А2 – только антиген А. Клетки А1 и А2 несут различное количество антигенного вещества, имеющего в то же время и некоторые качественные отличия. Так, сыворотки анти-А лиц, имеющих группу крови B(III), содержат 2 фракции анти-А-антител: одна фракция (анти-А) реагирует с эритроцитами А1 и А2, другая (анти-А1) – только c эритроцитами А1 (Wiener и соавт. [225, 227]). Адсорбция сывороток анти-А эритроцитами А2 позволяет получить реактив, который не реагирует с эритроцитами А2, но сохраняет высокую активность по отношению к эритроцитам А1 и может быть использован для

дифференцировки образцов эритроцитов А на А1 и А2 (Р.М. Уринсон [61]). Для определения подгрупп А используют экстраагглютинины α1 и α2, специ-

ально отобранные моноклональные антитела анти-А, а такжелектины Dolichos biflorus и Ulex europaeus. Первый из них реагирует с эритроцитами А1, второй – с эритроцитами А2.

У лиц А1 с частотой примерно 1 на 10 000 встречаются экстраагглютинины α2.Лица А2 и А2В содержат экстраагглютинины α1 с частотой1 на 50 и 1 на 5 соответственно.

Гены А1 и А2 передаются по наследству. Лица А1А2 имеют фенотип А1.

89

Присутствие аллеля А2 можно обнаружить при семейном исследовании. Если один из родителей передает аллель А2, а другой О или В, фенотип ребенка будет

А2 или А2В.

Оба аллеля (А1 и А2) кодируют синтез ацетилгалактозаминилтрансфераз, которые присоединяют терминальные углеводные группировки А к веществу Н. Указанные трансферазы отличаются друг от друга кинетической активностью, оптимумом рН, изоэлектрическимиточками.А1-трансферазаобладаетбольшейактивностью.

N-ацетилгалактозамины как акцепторный субстрат также, по-видимому, не идентичны, что вносит свой вклад в разнообразие строения антигена А.

Предполагают, что различия А1 и А2 обусловлены липидсвязанными цепями 3 (тип 3Н и 4Н). Поскольку А1-трансфераза более активно присоединяет терминальные углеводные группировки, на цепях 3Н эритроцитов А1 образуется большее число А-антигенных копий, а на цепях 3Н клеток А2 в силу меньшей активности А2-трансферазы образуется меньшее число копий. Таким образом, 3Н-цепи лиц А2 получают существенно меньше вещества А. В то же время на них остается больше вещества Н, чем и объясняется большая экспрессия Н-антигена на эритроцитах А2 по сравнению с эритроцитами А1.

В количественном отношении антиген Н находится в реципрокных соотношениях с А и В. Как отмечено выше, иммунодоминантные А- и В-сахара присоединяются к Н-цепям типов 1, 2, 3 и 4. По мере увеличения количества присоединенных А- или В-антигенных группировок содержание серологически выявляемой субстанции Н уменьшается. Поскольку фенотипы А1 и В несут большее количество иммунодоминантных группировок, серологически выявляемое количество антигена Н на таких клетках минимально. Иными словами, исходное количество вещества Н на клетках указанных групп заблокировано или преобразовано в А- и В-детерминанты. Это убедительно подтверждают результаты сравнительного исследования содержания вещества Н на эритроцитах А2 и О. Эритроциты А2 содержат меньше антигена А, однако количество антигена Н на них выше по сравнению с клетками А1 и В. На эритроцитах А2 для антител анти-Н доступно гораздо большее количество соответствующих антигенных участков. Количество антигена Н на эритроцитах А1 и В иногда настолько мало, что некоторые из носителей этих фенотипов вырабатывают анти-Н-антитела, не реагирующие с собственными клетками. У лиц А2 анти-Н-антитела не образуются.

Предположение о том, что вещество Н экранировано на клетках детерминантами А и В подтверждается и тем, что эритроциты А3, Ах и других слабых подгрупп по количеству содержащегося в них вещества Н приближаются к клеткам группы О. Поскольку аллель О является молчащим, вещество Н на эритроцитах О свободно от группоспецифических углеводных группировок. В силу этого эритроциты О реагируют с анти-Н-антителами более интенсивно, чем клетки А2, и анти-Н-антитела у лиц О никогда не образуются.

Интересная деталь, эритроциты группы О удавалось преобразовать in vitro в А или В посредством обработки А- или В-трансферазой в присутствии А- и

90