Материал: Донсков С.И., Мороков В.А. Группы крови человека. Руководство по иммуносерологии

проназойилихимотрипсином,приэлектрофорезевполиакриламидномгеле(SDSPAGE) оказался неоднородным (Mueller, Morrison [123]). В большинстве образцов присутствовали фракции с мол. массой 60 кДа, представляющие N-терминальный регион,инебольшоеколичествокомпонентовсмол.массой63кДа.

Один из вариантов протеина полосы 3, названный Мемфис, обусловлен точковой мутацией в паре нуклеотидов внутри экзона 4, которая приводит к замещению лизина на глютаминовую кислоту в цитоплазматическом N-терминальном домене белка полосы 3 (Yannoukakos и соавт. [176], Jarolim и соавт. [76]). У некоторых индивидов, гомозиготных по указанному мутантному гену, присутствовал только протеин с мол. массой 63 кДа (Ranney и соавт. [138], Ideguchi и соавт. [62]). Вариант Мемфис протеина полосы 3 был обнаружен у 6–7 % произвольно взятых доноров. Его частота оказалась выше среди американских негров (16 %), индейцев (17–25 %), китайцев (13 %), жителей Филиппин (17 %) и японцев (29 %) (Yannoukakos и соавт. [176], Jarolim и со-

авт. [76]). Ингибиторы эритроцитарного транспортера анионов диизотиоцианатстилбен (DIDS) и его дигидрат (H160mIDS) ковалентно связывались с лизином в позиции 539 белка полосы 3 (Tanner и соавт. [160]). У некоторых индивидов с Мемфис-вариантом белка полосы 3 отмечено повышенное связывание H160mIDS (Hsu, Morrison [60]). Такой тип белка полосы 3 был обозначен как Мемфисвариант II для дифференцировки с Мемфис-вариантом I, которому свойствен нормальный уровень связывания H160mIDS.

Spring et al [157] указали на ассоциацию между фенотипами системы Diegо и вариантами протеина полосы 3 при исследовании в SDS-PAGE. Они установили, что наличие Мемфис-варианта II всегда было ассоциировано с наличием на эритроцитах антигена Di a. Белок полосы 3 таких эритроцитов связывал в 3 раза больше H160mIDS с радиоактивной меткой, а клетки Di(a −) проявляли нормальный уровень связывания H160mIDS. Таким образом, эпитопы Di a ассоциированы с протеином полосы 3 Мемфис-варианта II, а другие варианты этого белка (Мемфис-вариант I и обычный) – с антигенными эпитопами Di b.

Bruce и соавт. [16], проведя амплификацию кодирующего региона белка полосы 3 для выделения кДНК, сумели доказать, что экспрессия антигена Di a и Мемфис-варианта II ассоциированы с заменой С 2561 Т в экзоне 19: ген Di a кодирует лейцин в позиции 854, а в присутствии Di b это положение занимает пролин. Кроме того, внутри гена Di a отсутствуют сайты рестрикции MspI и NaeI. В соответствии с моделью, в которой трансмембранная часть протеина полосы 3 представлена 14 доменами, аминокислотные замены имеются в 7 экстрацеллюлярных петлях белка (рис. 12.2). Повышенное связывание H160mIDS происходит в связи с локальными пространственными изменениями, влияющими на перекрестные связи между лизином в положении 851 на седьмой петле и той же аминокислотой в положении 539 в трансмембранном домене (Salhany и соавт. [150]).

При исследовании генотипа с помощью ПЦР у 72 бразильских индейцев племени Паракана из Амазонии выявлено 26 индивидов Di a / Di a, 26 – Di a / Di b

661

Рис. 12.2. Локализация антигенных эпитопов Diegо на эритроците и топология протеина полосы 3.

и 19 – Di b / Di b. Таким образом, в этой этнической группе гены Di a и Di b имели частоту 0,56 и 0,44 соответственно (Castilho и соавт. [24]). Анализ вариантов Мемфис белка полосы 3 с рестрикцией MspI подтвердил корреляцию аллелей Di a и Di b с кодонами Glu 56 и Lys 56 соответственно. Исключение составили индивиды Di a / Di a, гетерозиготные по Glu 56 и Lys 56 кодонам.

Jarolim и соавт. [74] описали 2 европеоидов Di(a +b −), гетерозиготность которых (Di a / Di b) подтверждалась молекулярно-генетическими тестами. У одного из них выявлена мутация, изменявшая рамку считывания, у другого – нонсенскодон внутри Di b.

Антигены Di a и Di b устойчивы к действию папаина, трипсина, α-химотрипсина, проназы,сиалидазыисульфгидрильнымредуцентам(Daniels[36]).

Иногда антиген Di b может быть слабо выражен. Описана мексиканская женщина, фенотип которой при первичном исследовании был определен как Di(a −b −). Однако последующие исследования выявили у нее слабый антиген Di b (Biro и соавт. [14]). Низкий уровень экспрессии антигена Di b у нескольких мексиканцев с фенотипом Di(a + ) описали Edwards-Moulds, Alperin [42]). При обследовании 784 жителей Америки испанского происхождения Issitt и соавт. [70] установили, что все они имеют антиген Di b, в 11 случаях последний был слабо выражен. Исследование этих образцов с сыворотками анти-Di a лишь в одном случае выявило этот антиген. Таким образом, феномен слабой экспрессии антигена Di b не был связан с эффектом дозы. Сниженная экспрессия антигена Di b имелась у лиц с овалоцитозом, встречающимся в Юго-Восточной Азии

(Kusnierz-Alejska, Bochenek [89]).

662

Протеин полосы 3

Белок полосы 3, отвечающий за транспорт анионов (АЕ1, или CD233), входит в структуру гликопротеинов эритроцитарной мембраны. Каждый эритроцит содержит примерно 1,2 млн молекул этого белка, который легко выявляют электрофорезом в полиакриламидном геле после обработки субстрата додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE). Он мигрирует в область структур, име-

ющих мол. массу 100 кДа (Bruce, Tanner [18], Tanner [158, 159]).

Ген SLC4A1, контролирующий синтез белка полосы 3, имеет величину 18 кб и включает 20 экзонов (Schofield и соавт. [151]). Клонирование и секвенирование геномной ДНК белка полосы 3 подтвердило, что эта структура состоит из 3 доменов. Цитоплазматический N-терминальный домен состоит из 403 аминокислот, гидрофобный трансмембранный домен представлен 479 аминокислотами, С-терминальный – 29 (см. рис. 12.2, 12.3) (Tanner

исоавт. [160], Lux и соавт. [112]). Терминальный N-домен взаимодействует с анкирином цитоскелетона. Трансмембранная часть белка полосы 3 в эритроците включает 14 доменов, экстрацеллюлярная часть представлена 7 петлями (см. рис. 12.2). Участок, связанный с олигосахаридами в области Asn 642 на четвертой экстрацеллюлярной петле, обладает серологической активностью в отношении антител анти-H, анти-A, анти-B, анти-I и анти-i. Количественные вариации протеина полосы 3 подсчитаны по числу повторяющихся N-ацетил- лактозаминовых группировок. Белок полосы 3 в мембране эритроцитов представлен олигомерами (ди-, три-, тетра- и т. д.) (Popov и соавт. [136], Fujinaga

исоавт. [46]). Тетрамеры преимущественно связаны с анкирином (Van Dort и

соавт. [167], Zafar, Reid [180]).

Рис.12.3.Аминокислотнаяпоследовательностьпротеинаполосы3эритроцитовчеловека.

663

Ассоциация антигенов Diegо с протеином полосы 3 и гликофорином А

Протеин полосы 3 тесно связан в мембране эритроцитов с гликофорином А. Антитела к протеину полосы 3 преципитировали как этот белок, так и гликофорин А (Wainwright и соавт. [169], Tanner [160]). Антитела против гликофорина А существенно снижали подвижность протеина полосы 3 (Nigg и соавт. [125], Che, Sherry [26], Paulitschke и соавт. [130]).

ПомнениюGroves,Tanner[53]гликофоринАспособствуетпереносувновьобразовавшихся молекул белка полосы 3 в мембрану эритроцитов. Однако гликофорин А не является строго обязательной структурой, необходимой для экспрессии белка полосы 3, хотя при его дефиците протеин полосы 3 медленнее движется к мембране и его прикрепление к ней остается незавершенным. В эритроцитах, дефицитных по гликофорину А, протеин полосы 3 имеет более высокую мол. массу и, несмотря на его нормальное количественное содержание, транспорт анионов через мембрану таких эритроцитов затруднен. Эритроциты мышей, у которых направленно был инактивирован ген белка полосы 3 (нокаутные мыши), имели низкое содержание как протеина полосы 3, так и гликофорина А, что дало основание полагать, что белок полосы 3 важен для формирования гликофорина А на мембране эритроцитов (Hassoun и соавт. [57]). Однако эти экспериментальные данные вряд ли можно экстраполировать на человека, поскольку у человека в процессе гемопоэза гликофорин появляется на мембране эритроцитов раньше белка полосы 3 (Southscott и соавт. [156], Daniels, Green [38]). В то же время эритролей-

кемическая линия клеток человека K562 экспрессирует гликофорин А, а протеин полосы 3 не экспрессирует (Gahmberg,Andersson [48], Beckman и соавт. [11]).

Ribeiro и соавт. [142] описали ребенка с полным отсутствием белка полосы 3, однако его эритроциты при этом содержали, хотя и в небольшом количестве, гликофорин А.

Эритроциты трансгенных мышей экспрессировали гликофорин А человека, но в то же время содержание в них мышиного гликофорина А было снижено. Это указывает на возможную конкуренцию двух разных в видовом отношении гликофоринов, участвующих в формировании белка полосы 3 (Auffray и соавт. [10]).

Антиген Wr b не экспрессируется в отсутствие гликофорина А. Эритроциты с дефицитом гликофорина А имеют фенотип En(a −) по системе MN и Wr(a −b −) по системе Diegо (Issitt и соавт. [68, 69]). Образцы эритроцитов Wr(a −b −), которые содержали некоторое количество гибридных гликофоринов, реагировали с антителами анти-En a. Эритроциты индивидов Wr(a +b −) имели нормальную экспрессию антигенов M, N, S, s и En a (Dahr и соавт. [35]). Секвенирование гена GYPA у лицWr(a +b −) не выявило каких-либо особенностей (Bruce и соавт. [17]).

Большинство моноклональных антител к гликофорину А преципитировало указанный гликофорин, но не преципитировало белк полосы 3. Преципитация гликофорина А происходила с анти-Wr b-антителами (Ridgwell и соавт. [144, 145]), которые одновременно преципитировали и протеин полосы 3 (Telen,

664

Chasis [163], Ring и соавт. [147]), обнаруживая тем самым структурное сходство обоих антигенных субстратов. Шесть образцов сывороток с аутоантителами также вызывали преципитацию протеина полосы 3 и гликофорина А (Leddy

исоавт. [97]). Антитела анти-Wr b содержались лишь в 3 из 6 упомянутых сывороток с аутоантителами, и это свидетельствует о том, что могут существовать другие антигенные эпитопы, общие для протеина полосы 3 и гликофорина А.

Гемагглютинирующую активность аллоиммунных антител анти-Wr b оказалось возможнымингибироватьочищеннымифрагментамигликофоринаА,ноингибирующаяактивностьбыланизкойиееможнобыловыявитьлишьвприсутствиилипидов(Dahrисоавт.[35]).АктивностьодногообразцамоноклональныхантителантиWr b угнеталась синтетическим пептидом, имеющим аминокислотную последовательность, свойственную гликофорину А в положениях 56–70. Этот синтетический пептид не снижал активность аллоиммунных, аутоиммунных, а также двух образцов моноклональных антител анти-Wr b (Rearden [139]). Моноклональные антитела не связывались с клеточными линиями человека, не экспрессирующими гликофорин А и белок полосы 3 (Telen, Chasis [163]). Клеточная линия K562 экспрессируетгликофоринАбезпротеинаполосы3иантигенаWr b,однакотрансфекцияклеток кДНК белка полосы 3 индуцировала экспрессию антигена Wr b (Beckman и соавт. [11]). В экспериментах с искусственным эритропоэзом in vitro белок полосы 3

иантиген Wr b появлялись на клетках в одно время, после гликофорина А (Daniels, Green [38]). Связывание антител с экстрацеллюлярным доменом гликофорина А вызывало одновременно иммобилизацию протеина 3, этот эффект был заметно сниженприиспользованииэритроцитовWr(a +b −)(Paulitschkeисоавт.[130]).

Bruce и соавт. [17], Huang и соавт. [61], Poole [132] сравнили аминокислотную последовательность гликофорина А, гибридного гликофорина GP(B-A)Sch., ассоциированного с антигеном Wr b, а также гибридов GP(A-B)Hil и GP(B-A)Dantu, ассоциированных с фенотипомWr(a −b −). Результаты позволили заключить, что аминокислоты в позициях 55–68 α-спирального региона, близкого к месту встраивания гликофорина А в мембрану эритроцитов, могут играть важную роль в экспрессии антигена Wr b. Аминокислотные замены Gln 63 Lys и Ala 65 Pro ассоциированы с необычно высокой экспрессией антигена Wr b. На эритроцитах с гибридными гликофоринами, экспрессирующими антиген SAT, фактор Wr b отсутствовал, несмотря наналичиеаминокислот,происходящихизучастков1–70или1–71гликофоринаА. Вероятно, что взаимодействие протеина полосы 3 и гликофорина А происходит через трансмембранный домен гликофорина А и восьмой трансмембранный домен белка полосы 3, а также через экстрацеллюлярные участки, находящиеся рядом с этимитрансмембраннымидоменами.

Таким образом, связь гликофорина А и протеина полосы 3 очевидна. Эритроциты En(a −) M kM k не содержат гликофорина А и являются Wr(a −b −). Антиген Wr b отсутствует на эритроцитах, несущих гибридные гликофорины

GP.Hil, GP.TSEN, GP.SAT, GP.TK или GP.Dantu. Во всех случаях в позиции 658

протеина полосы 3 присутствует глютаминовая кислота, однако для экспрессии

665