Материал: Донсков С.И., Мороков В.А. Группы крови человека. Руководство по иммуносерологии

хлорамфениколацетилтрансферазу (ХАТ). В клетках, подвергнутых трансфекции, отметили высокий уровень ХАТ-активности. Трансфекция клеток фрагментами ДНК, содержавшими Fy-специфическую T 33 C GATA-мутацию, не приводила к появлению ХАТ-активности в эритроидных клетках, однако в клетках эндотелиальной линии ее наблюдали.

Из 1062 обследованных жителей Папуа – Новой Гвинеи 23 оказались гетерозиготными по Fy a-специфической последовательности Gly 42 и GATA-мутации, типичной для аллеля Fy. Частота аллеля составила 0,022 (Zimmerman и соавт. [184]). По-видимому, указанный аллель ведет себя как молчащий в отношении эритроидных клеток, поскольку эритроциты таких лиц имеют слабую экспрессию антигена Fy6 по сравнению с эритроцитами гомозигот Fy a / Fy a.

Фенотип Fy(a −b −), типичный для негроидов, встречается крайне редко среди представителей других рас и этнических групп (Mourant и соавт. [118]). Он не был найден среди 6 тыс. белых жителей Австралии при их обследовании с помощью сыворотки анти-Fy3 (Albrey и соавт. [10]).

Chown и соавт. [35], Lewis и соавт. [92] рассчитали, что частота гена Fy среди лиц белой расы составляет около 0,001; ожидаемая частота фенотипа Fy(a −b −) – 1 на 1 млн. В нескольких семьях выявлено необычное наследование генов Fy a и Fy b, обусловленное, как полагают Chown и соавт. [35], присутствием аллеля Fy x.

Людей Fy(a −b −) среди европеоидов и монголоидов обычно идентифицировали в связи с обнаружением в сыворотках их крови активных антител антиFy3. У одной из австралийских женщин Fy(a −b −) имелась делеция 14 пар кодонов гена FY (Albrey и соавт. [10]), которая изменяла рамку считывания и приводила к прекращению трансляции (Mallinson и соавт. [99]). Молекулярногенетические методы исследования позволили выявить у 3 неродственных лиц гомозиготность по нонсенс-мутациям, приведшим к формированию фенотипа

Fy(a −b −):

––G 408A(Trp 136 Stop) в гене Fy a у англичанки (Rios и соавт. [139]);

––G407A(Trp96Stop)вгенеFy b уливанскойеврейки(Riosисоавт.[139]);

––G 287A(Trp 136 Stop) в гене Fy a у индианки из Канады (Buchanan [23], Rios и соавт. [139]).

Tsuneyama и соавт. [165] наблюдали японку Fy(a −b −), без антител, имевшую делецию С327, которая приводила к остановке считывания 12 кодонов ниже 120-го.

Каждая из мутаций, описанных выше, проявляла себя отсутствием экспрессии антигенов Duffy на эритроцитах в отличие от GATA-мутаций, способствующих формированию африканского варианта фенотипа Fy(a −b −), при котором Duffy-гликопротеины экспрессированы на неэритроидных клетках.

Фенотип Fy(a −b −) без антител анти-Fy3 описан у чешских цыганок (Libich и соавт. [94], Pisacka и соавт. [134]), белой женщины шотландско-швейцарского происхождения, имевшей GATA-мутацию, характерную для негроидов.

611

Гликопротеин Fy и ген Fy

Moore и соавт. [115], используя методы иммунопреципитации, установили, что антиген Fy a присутствует на 3 протеинах, имеющих мол. массу 39, 64 и 85 кДа. Иммуноблоттинг с антителами анти-Fy a позволил выявить структу-

ры с мол. массой 35 – 43 (Hadley и соавт. [60]) и 40–50 кДа (Tanner и соавт. [156]). Субстрат, выделенный электроэлюцией из протеинов 35–43 кДа, ингибировал антитела анти-Fy a [60]. Аналогичные результаты получили Nichols и соавт. [124], Riwom и соавт. [140], использовавшие иммуноблоттинг с моноклональными антителами анти-Fy6.

Обработка эритроцитов эндо-F-гликаназой, N-гликаназой и сиалидазой снижала мол. массу выделяемых с помощью иммуноблоттинга Fy-гликопротеинов до 4 кДа (Hadley и соавт. [60], Tanner и соавт. [156]).

Riwom и соавт. [140] и Wasniowska и соавт. [172] выделили низкомолекулярные фракции из очищенных Fy-гликопротеинов и третичных структур, полученных из них. Указанные исследования свидетельствовали о том, что Fyгликопротеины N-гликозилированны и слабо О-гликозилированы. Разная степень N-гликозилирования, вероятно, и обусловливает колебания мол. массы Fyгликопротеинов в широком диапазоне (Chaudhuri и соавт. [30]).

Chaudhury и соавт. [30] посредством иммунопреципитации моноклональными антителами анти-Fy6 выделили Fy-гликопротеин с мол. массой 36–43 кДа вместе с олигомерами большей мол. массы, последние также реагировали с указанными антителами. Другие из сопутствующих протеинов не реагировали в реакции иммунного окрашивания с антителами анти-Fy6. Картирование пептидов, выделенных из эритроцитов Fy(a +b −) и Fy(a −b + ), существенных различий не выявило (рис. 10.2).

MGNCLHRAEL SPSTENSSQL DFEDVWNSSY GVNDSFPDGD YDANLEAAAP 50 CHSCNLLDDS ALPFFILTSV LGILASSTVL FMLFRPLFRW QLCPGWPVLA 100 QLAVGSALFS IVVPVLAPGL GSTRSSALCS LGYCVWYGSA FAQALLLGCH 150 ASLGHRLGAG QVPGLTLGLT VGIWCVAALL TLPVTLASGA SGGLTCLIYS 200 TELKALQATH TVACLAIFVL LPLGLFGAKG LKKALGMGPG PWMNILWAWF 250

Рис. 10.2. Аминокислотная последовательность Fy-гликопротеина.

Chaudhury и соавт. [28], изучив последовательность аминокислот в очищенных Duffy-гликопротеинах, сконструировали олигонуклеотидные праймеры и с помощью ПЦР изменили кодирующий участок ДНК, полученной от лиц Fy(a −b + ). Затем этот продукт был использован для выделения кодирующей ДНК из библиотеки ДНК костномозговых клеток человека. В результате исследования получен пептид из 338 аминокислот с мол. массой 35,7 кДа (рис. 10.3).

Neote и соавт. [123] установили, что Fy-гликопротеин структурирован в виде α-спиралей, 7 раз пересекающих мембрану эритроцитов, имеет

612

Рис. 10.3. Генетическая карта локуса Fy.

экстрацеллюлярный N- и цитоплазматический С-домены (см. рис. 10.1). Такое строение свойственно хемокиновым рецепторам (Ji и соавт. [81], Murdoch, Finn [120]). Экстрацеллюлярный домен, состоящий из 65 аминокислот, имеет 3 участка N-гликозилирования – позиции 16, 27 и 33. Антитела анти-Fy6 реагировали с синтетическим пептидом, представляющим собой фрагмент N-терминального домена Fy-гликопротеина.

Первая из полученных образцов Duffy кДНК была представлена одним эк-

зоном (Chaudhuri и соавт. [29], Iwamoto и соавт. [79], Tournamille и соавт. [160]).

Позднее Iwamoto и соавт. [77] показали, что в неэритроидных тканях преобладают транскрипты, состоящие из двух экзонов, разделенных 479 парами кодонов. Первый экзон кодирует семь N-терминальных аминокислот Fyгликопротеина, включая инициирующий трансляцию метиониновый кодон. Терминальный участок молекул Fy-гликопротеина представлен последователь-

ностью MGNCLHRAEL(Iwamoto и соавт. [77]).

В регионе 5' гена FY нет TATA- и CAAT-боксов, однако имеется несколько участков SP1 и GATA, препятствующих транскрипции (Iwamoto и соавт. [79], Tournamille и соавт. [160]).

Генотипирование

Установление нуклеотидных замен, обусловливающих специфичность Fy a, Fy b и Fy, позволило проводить генотипирование плодов беременных, сенсибилизированных к антигену Fy a, с целью оценки риска ГБН (Goodrick и соавт. [55]). Нуклеотидная замена G 159 A, определяющая различия Fy a / Fy b, создает сайт рестрикции BanI в аллеле Fy a, а замена T 67 C – сайт StyI, определяющий различия Fy / Fy ab аллеля Fy (Iwamoto и соавт. [78], Tournamille и соавт. [160]).

Генотип устанавливают с помощью ПЦР с использованием аллельспецифических праймеров С 67 (Fy), Т 67 (Fy a или Fy b), G 159 (Fy a), А 159 (Fy b или Fy)

613

(рис. 10.4) (Hessner и соавт. [69], Mullighan и соавт. [119], Olsson и соавт. [127]).

Использование комбинаций пар праймеров позволяет усилить продукты реакции и проследить последовательности кодонов (см. табл. 10.4).

Рис. 10.4. Принцип Duffy-генотипирования с

использованием ПЦР и аллельспецифических праймеров C ← Fya,A→ Fyab и G ← Fya,A← Fyb.

Больные серповидно-клеточной анемией, систематически получающие гемотрансфузии, часто образуют антитела к различным аллоантигенам эритроцитов, в том числе антигенам Duffy. Генотипирование доноров и реципиентов облегчает процесс подбора совместимых пар по указанной системе. Люди Fy(a +b −) отличаются по способности вырабатывать клинически значимые анти- Fy b-антитела, которые могут вырабатываться только у лиц с генотипом Fy a / Fy a, но не Fy a / Fy, поскольку аллель Fy кодирует синтез Fy b-гликопротеина в неэритроидных клетках. Таким образом, иммунная система лиц Fy a / Fy не воспринимает антиген Fy b как чужеродный.

Другие антигены Fy и антитела к ним

Fy3

Антиген Fy3 присутствует на эритроцитах всех людей, за исключением Fy(a −b −). Он широко распространен среди европеоидов и монголоидов, но встречается редко среди жителей некоторых регионов Западной Африки. В отличие от факторов Fy a и Fy b, антиген Fy3 устойчив к действию протеоли-

тических ферментов (Albrey et al [10], Buchanan и соавт. [23], Daniels [42], Mannessier и соавт. [100], Oberdorfer и соавт. [126]). Эритроциты приматов содержат антиген Fy3, а антигены Fy a и Fy b на них отсутствуют (Tippett, Gavin [157])

614

Антитела анти-Fy3 впервые обнаруженыAlbrey и соавт. [10] у австралийки Fy(a −b −), имевшей 3 беременности и получавшей гемотрансфузии. Антитела реагировали одинаково интенсивно с эритроцитами Fy(a +b −), Fy(a +b + ) и Fy(a −b + ), не разделялись на анти-Fy a и анти-Fy b дифференциальной адсорбцией. Четыре других найденных образца антител анти-Fy3 реагировали несколько интенсивнее с эритроцитами, содержавшими антиген Fy a (Mannessier

и соавт. [100]).

Антитела анти-Fy3 редко вырабатываются у негроидов, хотя имеются сообщения о выявлении у них нескольких таких образцов (Jensen и соавт. [80], Kosinski и соавт. [85], Molthan, Crawford [114], Oakes и соавт. [125], Oberdorfer

исоавт. [126], Sosler и соавт. [150]). Гораздо чаще у негроидов Fy(a −b −), получавших многократные гемотрансфузии, выявляли антитела анти-Fy a. Тем не менее, антитела Duffy встречаются редко и среди этой категории реципиентов. Так, скрининг сывороток 566 реципиентов-негроидов Fy(a −b −) во Франции ни в одном случае не выявил антител системы Duffy (LePennec и соавт. [89]).

Негроиды Fy(a −b −) гомозиготны по аллелю Fy и мутации в GATA-1 для эритроидных клеток. И хотя их эритроциты имеют фенотип Fy:–3, другие клетки экспрессируют гликопротеины Duffy (Peiper и соавт. [132]). Независимо от мутации в GATA-1 структура генов Fy b и Fy гомологична, поэтому гомозиготы Fy / Fy экспрессируют антигены Fy b и Fy3 в неэритроидных тканях. Это позволяет объяснить редкость антител анти-Fy3, а также анти-Fy b среди негроидов Fy(a −b −). В то же время они способны вырабатывать антитела анти-Fy a. Молекулярная структура фенотипа Fy(a −b −) негроидов, выработавших антитела анти-Fy3, отличается от таковой у негроидов Fy / Fy, не содержащих указанных антител. Более того, антитела анти-Fy3, образовавшиеся у негроидов Fy(a −b −) респондеров, способны улавливать различия в Duffy-гликопротеинах, экспрессированных на разных образцах эритроцитов и неэритроидных клеток.

Антитела анти-Fy3, полученные от негроидов, реагируют слабо или вовсе не реагируют с эритроцитами новорожденных (Kosinski и соавт. [85], Molthan, Crawford [114], Oakes и соавт. [125]), а антитела той же специфичности от лиц других рас реагируют с эритроцитами взрослых и новорожденных одинаково интенсивно (Buchanan и соавт. [23], Mannessier и соавт. [100]). Антигены Duffy

присутствуют на эндотелиальных клетках.

Описаны немедленные и отсроченные гемолитические трансфузионные ре-

акции (Mannessier и соавт. [100], Olteanu и соавт. [129], Vengelen-Tyler [168]), а также случаи легкой ГБН (Kosinski и соавт. [85], Molthan, Crawford [114], Oakes

исоавт. [125]), обусловленные анти-Fy3-антителами. ГБН купировали фототе-

рапией (Albrey и соавт. [10], Buchanan и соавт. [23]).

Мышиные моноклональные антитела анти-Fy3 в серологических реакциях проявляли себя так же, как и поликлональные аллогенные.

Исследования клеток насекомых, подвергнутых трансфекции кДНК, кодирующей гибридные молекулы Fy-гликопротеина и интерлейкина 8, показали, что

615