1. Время нахождения вируса у входных ворот
Вирус проникает через поврежденные покровы в мышечную и соединительную ткань
2. Время продвижения вируса к ЦНС и размножение в ней.
Проникнув в аксон нервной клетки, вирус сбрасывает оболочку и высвобождает в тело нейрона РНК и белки. Для транскрипции своей РНК и трансляции (синтеза пяти белков) вирус использует аппарат клетки. Новосинтезированные вирусные РНК и белки соединяются и образуют следующее поколение вирусных частиц, выходящих через дендриты и атакующие соседние нервные клетки. В это время никакие иммунологические защитные реакции организма еще не срабатывают Инфекционные болезни животных: учеб. пособие / Б.Ф. Бессарабов, А.А. Вашутин, Е.С. Воронин [и др.]. - М.: Колосс, 2007.-671 с.
3. Время появления вируса бешенства в слюне
Процесс размножения сопровождается уже центробежным движением вирусов по эфферентным волокнам периферических нервов. Вирус попадает во все органы и ткани, особенно в больших количествах накапливается в слюнных и слезных железах, роговице. В результате вирус появляется в слюне гораздо раньше наступления клинических признаков болезни.
2. Дополнительные сведения о признаках болезни
С момента проникновения возбудителя бешенства в рану человека или животного и до проявления первых признаков болезни проходит определенный промежуток времени, он называется скрытым или инкубационным периодом.
Инкубационный период продолжается: у собак от 1 до 3 месяцев; у КРС от 1 до 2 месяцев; у лошадей в среднем от 15 до 60 дней. Более коротким он бывает при многочисленных ранах от покусов в голову. Скрытый период от 3 до 6 месяцев наблюдается редко; от 6 месяцев до 1 года.
Болезнь протекает, как правило, в двух формах -- буйной и тихой. Отмечают также абортивную, атипическую и возвратную формы.
При буйной форме симптоматика проявляется в трех стадиях болезни: продромальной, стадии возбуждения и паралитической.
· В продромальной стадии (стадия предвестников) у животных начинается изменяться типичное поведение, проявляется беспричинное беспокойство. Иногда отмечается повышенная чувствительность к свету, шуму, расстраивается зрение, извращается аппетит, несколько повышается температура тела.
· В стадии возбуждения отмечаются приступы буйства, ярости, температура тела повышена, изменяются приобретенные рефлексы, теряется сознание, развиваются судороги, парезы жевательных мышц и мускулатуры глотки. Нередко у больных отмечается обильное слюноотделение, сужение зрачков, учащенное мочеиспускание, дефекация, иногда рвота. В начале стадии имеет место половое возбуждение животного. Количество и продолжительность приступов нарастает, снижается чувствительность, животное начинает слабнуть,
· В стадии параличей теряется болевая чувствительность, развиваются параличи мускулатуры глотки, гортани, языка, мышц глаз, жевательных мышц. Снижается температура тела. Затем быстро парализуются мышцы конечностей и всего туловища. Смерть наступает от паралича центра
При тихой (паралитической) форме бешенства возбуждение выражено слабо или вообще не выражено. У животного при полном отсутствии агрессивности отмечаются сильное слюнотечение и затрудненное глотание. У несведущих людей эти явления нередко вызывают попытку удалить несуществующую кость, и при этом они могут заразиться бешенством. Затем у собак наступает паралич нижней челюсти, мышц конечностей и туловища. Болезнь длится 2-4 дня.
Атипичные формы проявления бешенства, бывшие раньше редкостью, в настоящее время встречаются все чаще. Некоторые исследователи связывают это с новыми вариантами вируса бешенства или с недостаточностью иммунитета после антирабических прививок. Атипичная форма болезни не имеет стадии возбуждения. Отмечаются истощение и атрофия мускулатуры. Зарегистрированы случаи бешенства, которые протекали только при явлениях геморрагического гастроэнтерита: рвота, полужидкий кал, содержащий кроваво-слизистые массы. Животные быстро худеют, параличи проявляются перед смертью Ведерников В.А., Седов В.А., Ивановский Э.В. Бешенство животных. -М.: Колос, 1974.-114 с.
Так как в задании курсовой работы указан крупный рогатый скот, то рассмотрим характерное им течение болезни:
Инкубационный период более 3 месяцев. Он может быть короче - 14-18 дней, или растягиваться до года. Болезнь клинически проявляется также в двух формах: буйной и паралитической.
При буйной форме заболевание начинается с возбуждения. Животное часто ложится, вскакивает, бьет хвостом, топает, бросается на стену, наносит удары рогами. Агрессивность особенно выражена по отношению к собакам и кошкам. Отмечают слюнотечение, потливость, частые позывы к мочеиспусканию и дефекации, половое возбуждение. Такие приступы буйства чередуются с периодами ремиссии. Нередко в припадке бешенства животные погибают. Вскоре развиваются парезы и параличи в области глотки, тазовых, а впоследствии и передних конечностей. Затрудняется глотание, выделяется пенистая слюна. Припадки буйства становятся более редкими и менее сильными. Перед гибелью наблюдаются судорожные сокращения отдельных мышечных групп.
При тихой форме признаки возбуждения выражены слабо или отсутствуют. Наблюдаются угнетение, отказ от корма. У коров прекращаются секреция молока и жвачка. Затем появляются параличи гортани, глотки, нижней челюсти (хриплое мычание, слюнотечение) а затем задних и передних конечностей. Смерть наступает на 2- 4 день Инфекционные болезни животных: учеб. пособие / Б.Ф. Бессарабов, А.А. Вашутин, Е.С. Воронин [и др.]. - М.: Колос, 2007.-671 с.
3. Дифференциальная диагностика
Необходимо исключить болезнь Ауески, при которой больные животные неагрессивны, не бывает извращении аппетита, паралича нижней челюсти. У собак исключают нервную форму чумы, отличающуюся затяжным течением, высокой контагиозностью, возможностью выздоровления больных животных. Бешенство лошадей сходно по клинической картине с инфекционным энцефаломиелитом. Отличия: сильная желтушность слизистых оболочек, отсутствие агрессивности, выздоровление некоторых больных. Подозрение на бешенство может возникнуть при отравлениях, коликах и других незаразных болезнях, для которых характерны сильные боли и беспокойство животных, а также при наличии инородных тел в ротовой полости или глотке, закупорке пищевода. Но в таких случаях не развиваются типичные для бешенства параличи. Однако для точной дифференциации всех этих болезней от бешенства необходимы лабораторные исследования.
Взятие и подготовка материала для диагностики
При работе с больными животными и инфекционным материалом необходимо строго соблюдать меры личной безопасности: надевать резиновые перчатки, халаты с нарукавниками, резиновый или полиэтиленовый фартук, защитные очки, защитную маску для лица МУ 3.1.3114/1--13 Организация работы в очагах инфекционных и паразитарных болезней. [Электронный ресурс]. Режим доступа- https://rospotrebnadzor.ru/documents/details.php?ELEMENT_ID=4872. Дата обращения (19.04.19) .
Скрывать подозрительных на заболевание бешенством животных в полевых условиях запрещено.
В лабораторной диагностике вирусных болезней точность диагноза, прежде всего, зависит от правильности взятия патологического материала, его транспортировки. Материал для исследования от павших или вынужденно убитых животных следует брать как можно быстрее.
Для диагностики бешенства в лабораторию направляют трупы мелких животных, а от крупных и средних животных - голову с двумя первыми шейными позвонками. Для постановки биопробы допускается использовать пробы мозга, консервированные в 30-50% растворе глицерина.
Трупы перед отправкой на исследование обрабатывают инсектицидами.
Патологический материал: труп или голову, упаковывают в пластмассовые мешки, вкладывают в плотно закрывающиеся ящики с влагопоглощающей прокладкой, пропитанной дезинфектантом, мозг в банку с притертой стеклянной или резиновой пробкой, залитую парафином, или в любой другой водонепроницаемый контейнер. Патологический материал сопровождают документом, содержащим следующие данные: имя (название учреждения) и адрес отправителя, вид животного, анамнестические и клинико-эпизоотологические данные и доставляют в лабораторию с нарочным Белоусова Р.В., Троценко Н.И., Преображенская Э.А. Практикум по ветеринарной вирусологии: учеб. пособие. - 3-е изд., перераб. доп. - М.: КолосС, 2005. - 248 с.
Лабораторная диагностика
Методы лабораторной диагностики бешенства строго стандартизированы. Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30-09-2013 г. № 1127-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 26075-2013 введен в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2015 г.
Настоящий стандарт распространяется на все виды млекопитающих животных и устанавливает следующие методы лабораторной диагностики бешенства: метод флуоресцирующих антител (МФА); метод выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы - НГУК-1); биопроба на белых мышах; метод иммуноферментного анализа (ИФА); реакция диффузионной преципитации (РДП). Так же основанием для постановки диагноза является обнаружение в пат. материале телец Бабеша-Негри.
Вирусологический метод
Задача - поиск антигена возбудителя. В этот метод входит:
· Обнаружение телец-включений
· Выделение вируса в лабораторных моделях
· Идентификация, типизация и дифференциация вируса в МФА, ИФА,
Поиск телец Бабеша-Негри:
На предметных стеклах делают тонкие мазки или отпечатки из всех отделов головного мозга, не менее двух препаратов с каждого отдела мозга, и окрашивают по одному из методов (по Селлерсу, Муромцеву, Михину и т.д.).
При окраске по Михину мазки-отпечатки фиксируют в смеси спирта и эфира 5-10 мин, после чего просушивают фильтровальной бумагой и окрашивают в течение 30-40 мин краской Романовского-Гимза (1-2 капли на 1 мл дистиллированной воды). Быстро промывают подкисленным спиртом (1 капля ледяной уксусной кислоты на 30 мл 96%-го спирта), а затем водой, просушивают фильтровальной бумагой и приступают к исследованию Белоусова Р.В., Троценко Н.И., Преображенская Э.А. Практикум по ветеринарной вирусологии: учеб. пособие. - 3-е изд., перераб. доп. - М.: КолосС, 2005. - 237 с.. Пирамидальные нервные клетки приобретают синеватый цвет, ядро черное, интенсивно окрашенное, а тельца Бабеша-Негри розовато-красные с точечными включениями темно-синего цвета.
Выделение вируса
Согласно ГОСТу 26075-84, в качестве метода выделения возбудителя бешенства рекомендуется биологическая проба на белых мышах и культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы - НГУК-1) ГОСТ 26075-2013. Методы лабораторной диагностики бешенства.[Электронный ресурс]. Режим доступа- https://allgosts.ru/11/220/gost_26075-2013. Дата обращения (11.05.19)
Для биопробы используются мышата-сосуны или отъемыши весом 8-12 г. Мышей в количестве 6-10 штук заражают 10%-й суспензией патологического материала, при этом половину из них заражают интрацеребрально в дозе 0,015-0,03 мл., остальных подкожно в область верхней губы в дозе 0,1-0,2 мл. Предпочтительнее использовать мышат- сосунов, так как они более чувствительны. Наблюдают 30 дней. При оценке результатов учитывают наличие клинических признаков у зараженных мышей (взъерошенность шерсти, поедаемость корма, нарушение координации движения, параличи, тремор, прострация). Гибель мышей в первые двое суток после заражения не учитывают, так как чаще всего они погибают по другим причинам (бактериальная контаминация инокулята, его токсичность, травма во время заражения и т.д.). Пробы мозга от больных и погибших животных, начиная с третьих суток, исследуют в МФА.
Биопробу считают положительной, если, начиная с третьих суток после заражения, заболела и погибла хотя бы одна мышь и в пробе мозга с помощью МФА обнаружены специфические включения вируса бешенства.
Отрицательный диагноз может быть дан только по истечении 30 сут. наблюдения при условии, что все зараженные животные останутся живыми и здоровыми. Результаты биопробы считаются окончательными, дальнейшие исследования не проводят ГОСТ 26075-2013. Методы лабораторной диагностики бешенства.[Электронный ресурс]. Режим доступа- https://allgosts.ru/11/220/gost_26075-2013. Дата обращения (11.05.19).
Альтернативным методом выделения вируа является использование как биологической модели культуры клеток мышиной нейробластомы CCL-131 или невриномы Гассерова узла крысы - НГУК-1.
Культуру клеток инкубируют и добавляют суспензию мозга зараженных мышей. Выдерживают 42-48ч в термостате. Далее готовят мазок фиксируют химическим способом и окрашивают. На окрашенные препараты наносят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают в люминесцентном микроскопе.
В окрашенных препаратах не пораженная вирусом бешенства культура клеток светится тусклым, серовато-желтым цветом (отрицательный контроль). Антиген вируса бешенства выявляется в цитоплазме культуры клеток в виде ярких зеленых гранул различной формы и величины с четкими очерченными краями (положительный контроль).
Диагноз на бешенство считается установленным, если в нескольких полях зрения микроскопа в исследуемом препарате обнаруживают типичные желто-зеленые гранулы. Если в культуре клеток вирус бешенства не выявлен, то ставится отрицательный диагноз. Результаты выделения вируса бешенства в культуре клеток окончательные, дальнейшие исследования не проводят.
Идентификация, типизация и дифференциация вируса.
Метод флуоресцирующих антител (МФА)
Сущность метода флуоресцирующих антител заключается в специфическом взаимодействии флуоресцирующих антирабических антител с гомологичным антигеном вируса бешенства. Образующийся при этом комплекс "антиген-антитело", меченный ФИТЦ, обнаруживается визуально по характерному свечению в поле зрения при рассмотрении под люминесцентным микроскопом.
В окрашенных препаратах не пораженная вирусом бешенства мозговая ткань светится тусклым, серовато-желтым цветом. Антиген вируса бешенства выявляется в нейронах и вне клеток в виде ярких зеленых гранул различной формы и величины - от едва заметных до имеющих размер в диаметре 15-20 мкм. Иногда отмечается большое количество мелких ярких зеленых частиц (размером до 1 мкм) округлой и овальной формы.