Материал: Барановский

•стерилизация насыщенным паром под давлением (автоклавирование),

•дробная стерилизация (тиндализация), кипячение.

Методы холодной стерилизации:

•стерилизация фильтрованием,

•газообразными средствами,

•ультрафиолетовыми лучами и другими видами излучений

26. Основные требования к работе с главным и рабочим банками культуры клеток.

Главный банк клеток (ГБК) ― запас клеток, полученных из одного посевного пула клеток, сохраняемых в контейнерах в равных частях однородного состава на определенном уровне пассажа при температуре не выше минус 70 оС. Предназначен для последующего создания рабочего банка клеток.

Рабочий банк клеток (РБК) ― запас клеток однородного состава, полученных из ГБК на определенном уровне пассажа, сохраняемых в контейнерах в равных частях при температуре не выше минус 70 оС. Используются для получения производственной клеточной культуры.

Во время аттестации проверяют следующие показали ГБК и РБК

•Наименование клеточной культуры;

•Коллекционный шифр (клеточной линии, ГБК, РБК);

•История получения (происхождение) клеточной культуры и создания ГБК и РБК;

•Запас клеток (количество сохраняемых контейнеров в банках клеток, количество клеток в емкости);

•Номер пассажа и дата закладки клеток на хранение;

•Условия криоконсервации, режим хранения и жизнеспособность клеток после размораживания;

•Ростовые свойства (способ культивирования, питательная среда, посевная концентрация, метод снятия клеток, кратность рассева, температура культивирования, частота пассирования);

•Подлинность (морфология, кариологическая характеристика, молекулярно-генетические методы исследования);

•Стерильность (отсутствие микробных агентов, в том числе микоплазм);

•Присутствие посторонних вирусов, в том числе эндогенных;

•Туморогенность (если применимо);

•Онкогенность (если применимо);

•Стабильность биологических свойств (количество рекомендованных для производства пассажей

•Сфера применения, чувствительность к производственному штамму вируса.

28.Технология получения посевного материала и используемое оборудование. Микробиологический и химический контроль на данной стадии

При подготовке посевного материала необходимо пройти 3 стадии (на каждой стадии должны соблюдаться методы асептики и предотвращения заражения):

1)Подготовка и стерилизация оборудования и растворов

2)Приготовление посевного инокулята

3)Мероприятия по микробиологическому контролю

На первом этапе, мы подготавливаем всю необходимую нам лабораторную посуду (колбы, шпатели, пипетки, цилиндры и тд.). Они стерилизуются в автоклаве. Далее производят подготовку растворов и сред (фосфатный буфер, железо, магний, м.э и тд.), которые также стерилизуются.

Далее в ламинарном шкафу мы вносим в пробирку со скошенным агаром небольшое количество среды и петлёй смываем культуру с поверхности агара в колбу. Далее добавляем растворы и источник углерода (масла, глюкоза, фруктоза). И ставим на мешалку.

Во время подготовки инокулята микробиологический контроль проводят 2 раза. Первый после смыва музейной культуры в колбу, второй – перед посевом бактерий в ферментёр. Микробиологический контроль проводят методом посева в чашки петри на плотную питательную среду, предварительно при этом разводя культуру.

При необходимости проводят исследование био/химических показателей в инокуляте (концентрации азота, глюкозы, фруктозы, оптической плотности и тд.)

29. Устройство и эксплуатация ферментера. Основные параметры процесса биосинтеза и их контроль.

Эксплуатация. Программа BioSCADA Lab оборудование:

•термодатчик,

•pH-датчик,

•датчик растворённого кислорода,

•монометр,

•обороты мешалки,

•подача воздуха и питательных веществ,

•антипенная система.

30.Стерилизация ферментера, калибровка контрольно-измерительного

ианалитического оборудования. Технология стерильной подачи питательных растворов. Отбор и анализ проб, основные методики.

Для подготовки ферментера к процессу стерилизации, необходимо

провести следующие последовательные процедуры:

•помыть ферментер мыльным раствором с ополаскиванием дистиллированной водой;

•залить в ферментёр фосфатного буфера;

•поставить датчик pH, место присоединение кабеля закрыть колпачком;

•поставить датчик DO, место прикрепления кабеля закрыть фольгой;

•взять из ремкомплекта ферментера резиновую/силиконовую мембрану,

поставить в порт технологический и закрепить с помощью шестигранника на 2 мм;

•поставить пробоотборник;

•поставить воздушные фильтры PTFE 0.2 µm ø73 mm (воздух должен подаваться от направления надписи на фильтре) на систему подачи и выпуска воздуха;

•поставить на трипорт подачи питательных сред отрезки шлангов и обернуть фольгой;

•закрыть фольгой гнездо двигателя мешалки;

•закрыть зажимы на пробоотборнике;

•поставить ферментёр на стерилизацию в автоклав. Для предотвращения избыточного давления - гайки ферментёра завинтить не плотно;

•стерилизовать ферментер в автоклаве при давлении 1 атм., температуре

121°С, продолжительности 30 минут, после чего оставить остывать в автоклаве до комнатной температуры;

•извлечь ферментер из автоклава после остывания, предварительно закрутив гайки на крышке ферментера, и поставить на рабочую платформу.

Датчик pH калибруется по двум буферным растворам с известной величиной pH (4,00 и 7,00).

Для стерильной подачи во всех ферментационных системах предусмотрены перистальтические насосы, которые не позволяют осуществлять прямой контакт с подаваемыми питательными средами:

устанавливается шланг с иголкой, которая пробитием вставляется через стерильный вкладыш в верхний порт.

Для отбора пробы необходимо:

•подсоединить емкость для сбора пробы;

•открыть зажим перед шприцом и шприцом создать вакуум в емкости для сбора пробы;

•открыть зажим возле штуцера пробоотборника;

•после наполнения емкости, закрыть зажим возле штуцера пробоотборника, затем закрыть зажим перед шприцом;

•отсоединить емкость для сбора пробы от пробоотборника.

Анализ пробы включает в себя:

•Определение сухого веса;

•Входной контроль биомассы;

•Определение оптической плотности растущей культуры;

•Определение концентрации глюкозы в процессе ферментации;

•Определение содержание азота;

•Анализ выполняется не реже одного раза в два часа, аналогично стадии;

•Микробиологический контроль.