Материал: Біологічна та біоорганічна хімія_Мардашко О.О._ изд. 2008-342 с._ОНМедУ-2012

Етапи синтезу дочірніх ДНК на матриці ДНК

1.Ініціація синтезу ДНК. Синтез праймерів РНК (містять від 10 до 20 нуклеотидів).

2.Елонгація синтезу ДНК здійснюється за до-

помогою різних механізмів на лідируючому і відстаючому ланцюгах:

а) на лідируючому ланцюзі синтезується ланцюг ДНК від РНК-праймера до реплікаційної вилки ДНК-полімеразою ІІІ;

б) на відстаючому ланцюзі спочатку синтезуються окремі фрагменти Оказакі, кожний з яких починається з відповідного РНК-праймера і закінчується перед початком наступного РНКпраймера за допомогою ДНК-полімерази ІІІ;

в) після формування фрагментів Оказакі ДНК-полімераза І вирізає праймери і заміщає їх фрагментами ДНК;

г) розриви між окремими фрагментами Оказакі зшиваються ДНК-лігазою. Рибонуклеаза Н бере участь у гідролізі РНК запалу.

3.Термінація синтезу ДНК, тобто його завер-

шення, настає, коли вичерпується ДНК-матри- ця і трансферазні реакції припиняються. Точність реплікації ДНК надзвичайно висока, можлива одна помилка на 1010 трансферазних реакцій, однак вона зазвичай легко виправляється за рахунок процесів репарації.

Особливості реплікації ДНК в еукаріотів

Реплікація ДНК у хромосомах і мітохондріях еукаріотів відбувається теж напівконсервативним способом, однак має деякі особливості. Швидкість руху реплікаційної вилки в еукаріотів (приблизно 50 нуклеотидів за секунду) майже в

10разів нижче, ніж в Е. сoli.

Множинність пунктів «початку» реплікації

ДНК є загальним правилом для всіх клітин еукаріотів. У клітинах ссавців виявлені ті самі ферменти реплікації ДНК (розщеплюючі білки, РНКполімераза, ДНК-полімерази, рибонуклеаза Н, ДНК-лігази). Однак ці ферменти відрізняються за молекулярною структурою і властивостями від ферментів прокаріотів. ДНК-полімерази ядер (α , β , γ , ε ) і мітохондрій (γ -типу) мають 5′→ 3′ полімеразну активність. Найактивніша з них ДНКполімераза α . Вона, вочевидь, виконує ту ж функцію при реплікації, що й ДНК-полімераза ІІІ прокаріот. Полімерази β і ε беруть участь у репарації ядерної ДНК.

Як і у прокаріотів, у реплікаційній вилці один із ланцюгів — лідируючий, а другий — відстаючий. Лідируючий ланцюг синтезується безперервно, а відстаючий — фрагментами Оказакі. Ініціація починається з утворення РНК-прайме- ра (запалу).

Біосинтез ДНК на матриці РНК

Багато РНК-вмісних онкогенних вірусів (вірус Раушера і саркоми Рауса, вірус ВІЛінфекції) містять РНК-залежну-ДНК-полімеразу (ревертазу). Вона каталізує біосинтез молекули

ДНК на матриці РНК. Цей фермент зустрічається в пухлинних клітинах (наприклад лейкозних), а також у проліферуючих тканинах (наприклад ембріональних). До складу ревертази входять іони Zn2+, Mn2+, Mg2+, які активують цей фермент.

Етапи синтезу

1.Ревертаза синтезує на вірусній РНК комплементарний ланцюг ДНК, що призводить до формування гібридної молекули.

2.Руйнування вихідної вірусної РНК під дією РНК-ази в комплексі гібридної молекули.

3.На синтезованій ДНК як на матриці комплементарно синтезується нова ДНК.

Дослідження механізму синтезу ДНК на матриці РНК дозволяє розкрити багато закономірностей пухлинного росту і вірусних інфекцій,

атакож вказує на можливість передачі спадкової інформації від РНК на ДНК, всупереч основному постулату (потік інформації йде тільки в одному напрямку).

Механізм функціонування вірусу СНІДу

Найпростіші віруси мають у своєму складі тільки одну молекулу нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК) і оболонку з молекул білка. У вірусах не відбуваються процеси обміну речовин, вони здійснюються тільки в клітині-хазяїні, це паразитичні нуклеїнові кислоти. Віруси, які при своєму розмноженні ушкоджують клітини хазяїна, є збудниками захворювань і вважаються патогенними. До захворювань вірусної етіології зараховують синдром набутого імунодефіциту (СНІД), сказ, поліомієліт, кір, краснуху, віспу, гепатит, грип.

Вірус імунодефіциту людини (ВІЛ) є збудником захворювання, яке зветься синдром набутого імунодефіциту. Геном ВІЛ складається з двох молекул однониткової РНК. Вірус має двошаровий капсид (оболонка вірусу зветься капсид, а структура в цілому — нуклеокапсид) і оточений білоквмісною мембраною. Головним чином, ВІЛ інфікує Т-хелпери, що може призвести до виходу з ладу імунної системи.

При інфекції мембрана вірусу зливається з плазматичною мембраною клітини-мішені та ядро нуклеокапсида потрапляє до цитоплазми. Вірусна РНК спочатку утворює гібрид РНК/ ДНК, а потім за рахунок реплікації ДНК утворюється подвійна спіраль ДНК. Обидві реакції каталізуються зворотною транскриптазою вірусу (ревертазою). Подвійна спіраль ДНК інтегрується до геному клітини, де може залишатися в неактивному стані. При її активації спочатку за допомогою ферментів клітини-хазяїна транскрибується фрагмент РНК, що відповідає вірусному геному. При цьому здійснюється біосинтез мРНК, що кодує попередників вірусних білків. Потім білки вбудовуються до плазматичної мембрани клітини і там піддаються протеолітичній модифікації. Цикл закінчується відокремленням утворених вірусних частинок.

Окремі ділянки транскриптонів виконують різні функції. Одна група ділянок належить до інформативних, друга — до неінформативних. Інформативними є структурні гени (цистрони), що несуть інформацію про структуру поліпептид-

Вона обирає стартову точку транскрипції на ланцюзі ДНК, що називають промотором. Потім до σ -фактора приєднується кор-фермент і починається транскрипція; α -субодиниця, можливо, виконує функцію ініціації біосинтезу РНК; β -суб-

одиниці здійснюють основну каталітичну функцію (зв’язування субстратів і елонгація синтезу).

Крім того, відкрито ряд білків, що беруть участь у механізмі синтезу РНК у клітині — спеціальний фактор термінації — ρ -фактор (рофактор).

Веукаріот є три РНК-полімерази: I, II, III. Це білки, що складаються з кількох субодиниць і відрізняються за специфічністю транскрипції.

РНК-полімераза I відповідальна за синтез тільки р-РНК.

РНК-полімераза II — основний фермент, що каталізує синтез ядерних РНК (пре-мРНК), які є попередниками мРНК.

РНК-полімераза III каталізує переважно синтез транспортних РНК (тРНК).

Веукаріот роботу РНК-полімерази забезпечує велика кількість регуляторних білків (факторів транскрипції).

Взаємодія РНК-полімерази з промотором

Зв’язування РНК-полімерази з ДНК-матри- цею відбувається в специфічних ділянках — промоторах — за допомогою σ -субодиниці РНКполімерази. Промотор — це ділянка ДНК, яка містить інформацію, що повідомляє РНК-поліме- разі, де зв’язуватися, як щільно зв’язуватися і як часто ініціювати синтез РНК-ланцюга.

РНК-полімераза може утворювати нестійкий комплекс із ДНК-матрицею в будь-якій частині ДНК, що досить швидко дисоціює — це неспецифічний комплекс I, що ковзає по ДНК, досягаючи ділянки промотору. Потім РНК-полімераза формує стабільний комплекс із промотором. Спочатку утворюється комплекс промотору — так званий закритий комплекс промотору. Наступний етап включає конформаційні зміни в полімеразі, що приводить до «розплавлення» ДНК і розриву водневих зв’язків — це «відкритий комплекс промотору».

Етапи синтезу РНК на матриці ДНК (прокаріоти)

1.Ініціація. РНК-полімераза (σ + кор-фер- мент) зв’язується з промотором, утворюється «відкритий комплекс промотору», в якому відбувається поділ ланцюгів ДНК («плавлення»). Цей

процес звичайно здійснюється за 1–2 с. Початок синтезу РНК здійснюється за допомогою α -суб- одиниці РНК-полімерази.

2.Елонгація, тобто утворення полірибонуклеотидного ланцюга за допомогою α - і β -суб- одиниць, відбувається в напрямку 5′→ 3′ антипаралельно матричному ланцюгу ДНК. Коли в

процесі елонгації утворюється новий ланцюг РНК із 10 нуклеотидів, то σ -субодиниця дисоціює, кор-фермент, що залишився, продовжує полімеризацію до термінуючих ділянок, при цьому він рухається по ДНК-матриці (транслокація РНК-полімерази) (від лат. trans — через, locus — локальний), приєднуючи черговий нуклеотид, комплементарний тому дезоксирибонуклеотиду

ДНК, що у цей момент перебуває в ділянці активного центру РНК-полімерази.

3.Термінація (від лат. termination — закінчення). У ділянці ДНК, де закінчується ген, є послідовність нуклеотидів (термінуючий кодон), що читається в прямому та зворотному напрямку однаково. Цей термінуючий кодон зветься паліндромом (від грецьк. паліндром — біжи назад). Ділянка РНК, що утворюється на такій «паліндромній» послідовності, має вигляд «шпильки» з кінцевою YYY-послідовністю. Утворення такої послідовності в РНК призводить до дисоціації

комплексу ДНК-ферментРНК за допомогою білка-термінатора — ρ -фактора, що взаємодіє з полімеразним комплексом.

4.Дозрівання РНК (процесинг). Більшість РНК не можуть бути отримані у функціонально активній формі в результаті синтезу на матриці ДНК. При транскрипції утворюються попередники тРНК, р-РНК і мРНК. Потім у ядрі відбувається посттранскрипційна доробка (дозрівання, процесинг) цих попередників, і виходять функціонально активні рибонуклеїнові кислоти. Ці типи змін для транспортних і рибосомних РНК у прокаріот та еукаріот дуже схожі. Дозрівання мРНК має деякі особливості. Попередник мРНК — гетерогенна ядерна РНК (пре-мРНК, або гя-РНК). Посттранскрипційне дозрівання мРНК (процесинг) складається з трьох основних етапів:

— вирізання неінформативних ділянок із премРНК;

— зрощування «розірваних» інформативних ділянок — сплайсинг (від англ. splicing — з’єдну-

вати, сплітати);

— модифікація 5′- і 3′-кінцевих ділянок РНК: а) кепування — хімічна модифікація 5′-кінце- вої послідовності мРНК (від англ. сар — шапка);

б) поліаденілювання — хімічна модифікація 3′-кінцевої послідовності мРНК за допомогою приєднання поліаденілової послідовності.

Вирізання неінформативних ділянок премРНК здійснюється за допомогою рибонуклеаз

(екзо- й ендонуклеаз). Вони гідролізують фосфодіефірні зв’язки, починаючи з 5′-кінця, і залишають від пре-мРНК необхідну частину мРНК (екзони). Екзони, що залишилися, зрощуються в єдиний ланцюг за допомогою спеціальних РНК-

лігаз. Далі тут же в ядрі відбувається модифікація 5′- і 3′-кінців новоутвореної мРНК.

Хімічний зміст «кепування» полягає в приєднанні залишку 7-метилгуанозину до 5′-кінця

молекули мРНК і метилювання двох кінцевих нуклеотидів. 5′-Кеп, з’єднуючись зі специфічним білком, бере участь у зв’язуванні мРНК із рибо-

сомою, сприяючи ініціації синтезу білка.

На 3′-кінці в більшої частини молекул мРНК утворюються поліаденілові послідовності довжиною 100–200 нуклеотидних залишків (полі-А- мРНК). Поліаденілювання полягає в послідовному ферментативному приєднанні залишків АМФ

іфрагментів ААУАА до 3′-кінця мРНК.

Відомо, що «кеп» додається ще в ядрі, а поліаденілювання перебігає або в ядрі, або в цитоплазмі.

На відміну від прокаріот, в еукаріот є ядерна мембрана, через яку необхідно доставити готові РНК у цитоплазму, де відбувається синтез білка. Всі зрілі РНК транспортуються з ядра в цитоплазму в комплексі з білком-інформофероном, що додатково захищає їх від руйнування і сприяє переносу до рибосом, де і відбувається збірка білка з амінокислот, або трансляція.

Висновки

•ДНК реплікується напівконсервативним шляхом, кожна дочірня подвійна спіраль складається з одного материнського й одного ново-

утвореного ланцюга. Ланцюг росте у напрямку

5′→ 3′.

•Для реплікації необхідно утворення реплікаційної вилки. Фермент хеліказа розплітає матрицю; білки, що зв’язують ДНК, утримують ланцюги ДНК у розплетеному стані. Розплітанню ланцюгів сприяє обертання молекули ДНК за допомогою ДНК-гірази.

•Один ланцюг ДНК (лідируючий) реплікується безперервно у напрямку 5′→ 3′, другий (відстаючий) реплікується з утворенням коротких фрагментів, які називаються фрагментами Оказакі. Вони синтезуються у напрямку, протилежному напрямку руху реплікативної вилки.

•Утворення лідируючого ланцюга і кожного фрагмента Оказакі починається з синтезу праймазою короткої комплементарної ділянки РНК,

яка виконує функції запалу (праймер). Далі на 3′-кінці цього РНК-запалу за допомогою ДНКполімерази III синтезується дочірня ДНК.

•Клітини прокаріот містять три ДНК-поліме- рази. ДНК-полімераза I каталізує відщеплення праймера та заповнює вільні місця комплементарної ДНК. ДНК-полімераза ІІ виправляє помилки в ланцюгах ДНК. Головний фермент біосинтезу дочірньої ДНК — це ДНК-полімераза III.

•Реплікація ДНК в еукаріот відбувається також напівконсервативним шляхом, але швидкість просування реплікаційної вилки в еукаріот майже у 10 разів нижча за таку в E. coli. Для неї характерна наявність багатьох точок «початку» реплікації ДНК. У реплікаційній вилці є лідируючий та відстаючий ланцюги. Ініціація починається з праймера.

•ДНК-полімераза ядер (α , β , γ , ε ) та мітохондрій (γ -типу) має 5′→ 3′ полімеразну активність. ДНК-полімераза α виконує ту саму

функцію, що й ДНК-полімераза III прокаріот. Полімерази β та ε беруть участь у репарації ядерної ДНК.

•Пухлинні клітини (лейкозні), проліферуючі тканини (ембріональні), РНК-вмісні онкогенні віруси містять фермент ревертазу. Вона синтезує на вірусній РНК комплементарний ланцюг ДНК. Дослідження механізму синтезу ДНК на матриці РНК дозволяє розкрити багато закономірностей пухлинного росту та вірусних інфекцій.

•Транскрипція — це біосинтез РНК на матриці ДНК, синтезуються інформаційні, рибосомні та транспортні РНК у вигляді попередників. В

ядрі відбувається їхнє посттрансляційне дозрівання, або процесинг.

•Відрізок ДНК, який піддався транскрипції,

—це транскриптон, у прокаріот його називають опероном. До інформативних відрізків транскриптону належать структурні цистрони, або гени, які несуть інформацію про структуру поліпептидного ланцюга.

•Процес транскрипції каталізується РНКполімеразою, яка складається з 5 субодиниць; σ - фактор полімерази потрібен для розпізнавання промотору — сигналу початку ініціалізації.

•У тваринних клітинах, інфікованих онкогенними РНК-вмісними вірусами, утворюються РНК-залежні ДНК-полімерази. Ці ферменти транскрибують вірусну РНК з утворенням ДНК. Таким чином, гени, які зумовлюють розвиток раку (онкогени), можуть залучатися до геному клітини.

•Антибіотики, що блокують ДНК-матрицю, перекручують інформацію про РНК, яка синтезується, гальмують активність РНК-полімераз і таким чином інгібують транскрипцію.

•Інтеркалятори — це інгібітори біосинтезу білка на рівні реплікації. Вони утворюють ковалентні зв’язки між комплементарними ланцюгами і перешкоджають їхньому розкручуванню.

•Еукаріотичні мРНК утворюються з гетерогенних ядерних РНК (гяРНК). Модифікація їх

здійснюється за допомогою поліаденілювання 3′-кінця та кепування 5′-кінця.

12.4. БІОСИНТЕЗ БІЛКА В РИБОСОМАХ. ЕТАПИ І МЕХАНІЗМ ТРАНСЛЯЦІЇ, РЕГУЛЯЦІЯ

ТРАНСЛЯЦІЇ. АНТИБІОТИКИ — ІНГІБІТОРИ ТРАНСКРИПЦІЇ Й ТРАНСЛЯЦІЇ

Білки перебувають у процесі постійного розщеплення і синтезу. Найшвидше оновлюються білки крові, печінки, слизової оболонки кишечнику і підшлункової залози. За добу в людини синтезується в середньому 1,3 г білка на 1 кг маси тіла. Білки в організмі людини оновлюються приблизно протягом 24 тиж. Процес трансляції означає переклад «чотирилітерної мови нуклеїнових кислот на двадцятилітерну мову білків». Іншими словами, трансляція зводиться до синтезу білка в рибосомах. У цьому процесі тільки послідовність розташування нуклеотидів у мРНК визначає первинну структуру білка.

Генетичний код

Біосинтез білків (трансляція) відрізняється від інших типів матричних біосинтезів — реплікації та транскрипції. Механізм використання матриці при біосинтезі білків інший, ніж у випадку синтезу ДНК або РНК. Якщо реплікацію і транскрипцію можна порівняти просто з переписуван-

ням тексту, то трансляція — це дешифрування, декодування інформації про амінокислотну послідовність, записаної (закодованої) за допомогою нуклеотидної послідовності. Спосіб шифровки в нуклеїнових кислотах інформації про первинну структуру білків дістав назву біологічного коду (його називають також генетичним, нуклеотидним, амінокислотним кодом).

Одне з перших питань, що виникає при з’я- суванні структури біологічного коду, — це питання про кодове число, тобто про кількість нуклеотидних залишків, що кодують включення в білок однієї амінокислоти. Очевидно, що кодове число не може дорівнювати 1, тому що в цьому випадку за допомогою чотирьох нуклеотидів можна було б закодувати тільки чотири амінокислоти. При кодовому числі 2 кількість різних нуклеотидних пар дорівнюватиме числу перестановок із чотирьох елементів по 2, тобто 42 = 16, що теж не досить для кодування всіх амінокислот. Кількість різних нуклеотидів при кодовому числі 3 дорівнює 43 = 64. Це більше ніж утричі перевищує мінімальне число, необхідне для кодування 20 амінокислот. Експериментально доведено, що в біологічному коді кодове число дорівнює трьом: трійку нуклеотидних залишків (триплет), що кодують включення однієї амінокислоти, називають кодоном. Генетичний код має такі властивості.

1.Триплетність — кожній амінокислоті відповідає трійка нуклеотидів. Із 64 триплетів 61 використовується для кодування амінокислот, а три

—УАА, УАГ, УГА — позначають кінець матриці: на цих триплетах обривається подальше нарощування пептидного ланцюга — термінуючі триплети.

2.Неперекриваємість — кожний із триплетів генетичного тексту незалежний один від одного. Однак є дані, що код іноді може перекриватися.

3.Виродженість коду — тобто одна кислота може кодуватися двома або більшою кількістю триплетів. Причина виродженості коду полягає в тому, що головне суттєве навантаження несуть два перших нуклеотиди в триплеті, а третій не такий важливий. Звідси правило виродженості коду: якщо два кодони мають два однакових перших нуклеотиди, а їх треті нуклеотиди належать до одного класу (пуринового або піримідинового), то вони кодують одну і ту саму амінокислоту.

Однак із цього правила є два винятки: це кодон АУА, що повинен відповідати метіоніну, а кодон УГА, що є термінуючим, тоді як повинен відповідати триптофану. Виродженість коду має, вочевидь, пристосувальне значення.

4.Специфічність — кожній амінокислоті відповідають тільки певні кодони, які не можуть бути використані для іншої амінокислоти.

від відомого раніше. У ньому кодон УГА відповідає триптофану, а АУА — метіоніну, як того вимагає правило виродженості коду. Можливо, на початку еволюції в усіх найпростіших організмів був такий самий код, як і у мітохондрій, а потім він зазнав незначних відхилень.

Рибосомна білоксинтезуюча система

Біосинтез білка (трансляція) відбувається в цитоплазмі завдяки нуклеопротеїновим частинкам — рибосомам. Рибосоми скаладються з двох субодиниць, кожна з яких побудована з рибосомної РНК (рРНК) і багатьох білків. Рибосоми та їх субодиниці звичайно класифікують за коефіцієнтами седиментації. Так, коефіцієнт седиментації повної еукаріотичної рибосоми дорівнює близько 80 одиниць Сведберга (80 S), а коефіцієнт седиментації її субодиниць (білки та РНК)

— 40 S і 60 S.

Субодиниці рибосом клітин еукаріот містять чотири різні р-РНК і більше 70 різних білків в обох субодиницях, причому більша субодиниця (60 S) має три різні р-РНК: 28 S (4700 нуклеотидів), 5,8 S (160 нуклеотидів) і 5 S (120 нуклеотидів) — і близько 50 білків. Мала субодиниця містить усього одну молекулу 18 S р-РНК і близько 30 білків.

Рибосомні РНК утворюються із загального попередника всіх типів клітинних РНК, які синтезуються на матриці ДНК у ядрі. Рибосомні білки мають цитоплазматичне походження, потім вони транспортуються в ядерця, де і відбувається спонтанне утворення рибосомних субодиниць шляхом об’єднання білків із відповідною РНК. Утворені субодиниці транспортуються через пори ядерної мембрани назад у цитоплазму, де група рибосом разом із мРНК утворюють полісоми або полірибосоми, які беруть безпосередню участь у синтезі білка. Це пояснюється тим, що одна молекула мРНК може транслюватися водночас кількома рибосомами.

Аміноацил-тРНК-синтетази

У будь-яких клітинах живих організмів існують специфічні ферменти, які каталізують активування амінокислот і зв’язування останніх із певною тРНК — аміноацил-тРНК- синтетази. Ці ферменти мають абсолютну специфічність дії, оскільки вони розпізнають тільки одну яку-небудь α -амінокислоту і одну тРНК. Для тих амінокислот, для яких відкрито дві й більше тРНК, відповідна аміноацил-тРНК-син- тетаза каталізує аміноацилювання всіх цих

ганізмів. Останнім часом принцип універсальності коду похитнувся у зв’язку з тим, що в мітохондріях власний генетичний код відрізняється

ферменти досить чутливі також до аналогів амінокислот, які інгібують активування відповідних кислот.