Материал: Біологічна та біоорганічна хімія_Мардашко О.О._ изд. 2008-342 с._ОНМедУ-2012

Дезоксирибонуклеозиддифосфати за участю кіназ перетворюються на дезоксирибонуклеозидтрифосфати:

Дезоксирибонуклеозиддифосфат + АТФ →

→Дезоксирибонуклеозидтрифосфат + АДФ

Біосинтез тимідилових нуклеотидів

Тимідилова кислота (дТМФ) утворюється з дезоксиуридилової кислоти (дУМФ) за допомогою тимідилатсинтази. У цій реакції донором одновуглецевого фрагмента служить N5,N10-мети- лен-Н4-фолат, що перетворюється на дигідрофолат (Н2-фолат).

Інгібітори синтезу дезоксирибонуклеотидів унеможливлюють реплікацію ДНК і поділ клітини. На цьому засновано застосування інгібіторів тимідилатсинтетази — 5-фтордезоксиуридину, що у клітинах перетворюється на 5-фтордезокси- уридинмонофосфат. Ця речовина є структурним аналогом тимідилової кислоти, інгібує тимідилатсинтетазу, блокуючи тим самим синтез ДНК.

OH

5-Фтордезоксиуридинмонофосфат

Інша мішень дії інгібіторів синтезу дТМФ — регенерація метилен-Н4-фолату.

Деякі структурні аналоги фолієвої кислоти (аміноптерин, метатрексат) інгібують дигідрофолатредуктазу, блокуючи тим самим синтез дТМФ і ДНК.

Регуляція синтезу піримідинових нуклеотидів

1. На етапі утворення карбамоїлфосфату відбувається інгібування надлишком УТФ і ак-

тивація ФРПФ. Цей шлях є основним в організмі людини. Алостеричним інгібітором ферменту є кінцеві продукти синтезу: УТФ, ЦТФ. Фосфори- бозил-1-пірофосфат (ФРПФ) і АТФ збільшують активність ферменту, що є одним із механізмів забезпечення координування синтезу пуринів і піримідинів.

2.Ще один рівень контролю здійснюється за допомогою ОМФ-декарбоксилази, для якої УМФ

іменшою мірою ЦМФ є інгібіторами. На етапі утворення карбамоїласпартату з аспартату і карбамоїлфосфату негативним алостеричним ефектором є ЦТФ і позитивним модулятором — АТФ.

3.Пригнічення синтезу дТМФ:

а) структурні аналоги дУМФ (5-фторурацил) конкурентно зв’язуються з тимідилатсинтетазою

іперешкоджають утворенню тимідилових нуклеотидів і ДНК у цілому;

б) структурні аналоги птерину (аміноптерин, метотрексат) конкурентно пригнічують функцію дигідрофолатредуктази, яка відновлює фолієву кислоту, необхідну для утворення метилен-ТГФК

іперетворення дУМФ на дТМФ.

Порушення метаболізму піримідинів

Оротацидурія — виділення з сечею великих кількостей оротової кислоти. Відома спадкова оротацидурія, при якій виділяється до 1,5 г оротової кислоти за добу — це в 1000 разів більше, ніж у нормі. Хвороба пов’язана з недостатністю ферментів, які каталізують дві останні реакції синтезу УМФ (оротатфосфорибозилтрансферази й оротидилфосфатдекарбоксилази). У результаті виникає недостатність піримідинових нуклеотидів, необхідних для синтезу нуклеїнових кислот («піримідиновий голод»), а оротова кислота нагромаджується. При охолодженні організму таких хворих у них утворюється осад кристалів оротової кислоти.

Нагромадженню оротової кислоти сприяє відсутність регулювальної дії ЦМФ, алостеричного інгібітора першої реакції синтезу, оскільки концентрація в тканинах ЦМФ й інших піримідинових нуклеотидів низька. Тому синтез оротової кислоти відбувається з більшою швидкістю, ніж у нормі. За відсутності лікування спадкова оротацидурія призводить до розвитку необоротного різкого відставання розумового і фізичного розвитку. Для лікування цього захворювання застосовують уридин, що забезпечує утворення УМФ:

Уридин + АТФ → УМФ + АДФ.

Утворений УМФ включається в механізм інгібування першої реакції біосинтезу УМФ, а також усуває «піримідиновий голод». Лікування повинне тривати все життя. Оротацидурію може спричинити лікарський препарат алопуринол при лікуванні подагри, що приєднується до 5-фосфорибозил-1-пірофосфату (ФРПФ). Утворений нуклеотид інгібує оротидилатдекарбоксилазу, спричинюючи цим оротацидурію й оротидинурію.

12.3. ФЕРМЕНТИ ТА МОЛЕКУЛЯРНІ МЕХАНІЗМИ РЕПЛІКАЦІЇ ДНК. ТРАНСКРИПЦІЯ — БІОСИНТЕЗ РНК

Створення і передача генетичної інформації є провідними ланками стабільності спадкових ознак. Розрізняють три етапи реалізації генетичної інформації.

I етап — реплікація (або копіювання) ДНК —

утворення дочірніх молекул ДНК за правилом комплементарності, первинна структура яких ідентична материнській ДНК (напівконсервативний метод). Реплікація є основою таких процесів,

як рекомбінація, транспозиція і репарація.

II етап — транскрипція — синтез молекули РНК на матриці ДНК за правилом комплементарності, тобто відбувається переписування генетичної інформації, закладеної в нуклеотидній послідовності ділянки одного з ланцюгів ДНК, у нуклеотидну послідовність мРНК.

III етап — трансляція — переклад генетичної інформації, закладеної в нуклеотидній послідовності мРНК, на амінокислотну послідовність білка, синтезованого на рибосомі. Потік генетичної інформації, позначений як експресія генів, включає II етап — процес транскрипції й III етап

—процес трансляції.

Ядерний хроматин і хромосоми еукаріот

В ядрі еукаріот міститься майже вся ДНК клітини, яка має лінійну структуру. Перші етапи синтезу здійснюються в ядерці, яке знаходиться всередині ядра. В іншій частині ядра міститься хроматин, названий так за його здатність набувати характерного забарвлення. Хроматин складається з ДНК (близько 35 %), РНК (близько 2 %) і деяких специфічних білків (близько 60 %).

Ухроматині ДНК міцно зв’язана з гістонами — білками, функція яких полягає в щільній упаковці ДНК в ядрі. Завдяки цьому 46 молекул ДНК диплоїдного геному людини загальною довжиною близько 2 м, які містять сумарно 6·109

пар основ, можуть розміститися в ядрі діаметром 10 мкм. По дві молекули кожного з гістонів H2α , H2β , H3 та H4 утворюють октамер, обгорнутий сегментом ДНК довжиною 146 пар основ, які являють собою 1,8 витка спіралі поверх білкової структури. Ця частинка діаметром 7 нм називається нуклеосомою. Нуклеосома — це структурна одиниця хроматину, яка виконує, головним чином, функцію щільної упаковки.

Ділянка ДНК, яка безпосередньо не контактує з гістоновим октамером, взаємодіє з гістоном Н1. Цей білок закриває приблизно 20 пар основ і забезпечує формування суперспіральної структури — соленоїда — діаметром 30 нм. У проміжках між поділами клітин хроматин розподіляється випадковим чином по всьому ядру, а безпосередньо перед поділом збирається у гранулярні тільця — хромосоми. Коли хроматин конденсується з утворенням метафазної хромосоми, соленоїдні структури утворюють петлі діаметром 200 нм, які містять ДНК довжиною 80 000 пар основ. Петлі зв’язані з білковим остовом — ядерним

остовом, приблизно 20 петель утворюють мінідиски. Велика кількість міні-дисків складається в стопку, утворюючи хромосому. Внаслідок цього ДНК виявляється скрученою настільки щільно, що навіть найменша хромосома людини містить близько 50 млн пар нуклеотидів.

Група негістонових білків включає струк-

турні ядерні білки, велику кількість ферментів і факторів транскрипції, пов’язаних із певними ділянками ДНК, які здійснюють регуляцію експресії генів.

Під час інтерфази більша частка хроматину неконденсована. Морфологічно розрізняють еухро-

матин і гетерохроматин — більш конденсова-

ний, ніж еухроматин. Еухроматин відповідає ділянкам хромосом з активною транскрипцією. Характеристика хромосомного набору видоспецифічна, тобто властива тільки одному виду рослин чи тварин. Сукупність кількісних (кількість і розмір) і якісних (форма) ознак хромосомного набору соматичної клітини називають каріотипом. Кількість хромосом у каріотипі більшості видів живих організмів парна. Це пояснюється тим, що в соматичних клітинах знаходяться дві однакові за формою і розміром хромосоми: одна

— з батьківського організму, друга — з материнського. Хромосоми, однакові за формою та розміром, та ті, що несуть однакові гени, називають гомологічними. Хромосомний набір соматичної клітини, в якій кожна хромосома має свою пару, носить назву подвійного (диплоїдного) і позначається 2n.

Ковалентна модифікація гістонів

Гістони виявлені в хроматині всіх соматичних клітин еукаріотів (крім прокаріотів), завдяки високому вмісту основних амінокислот (аргініну та лізіну) виявляють лужні властивості. При рН=7 бокові групи залишків аргініну та лізіну протоновані й несуть позитивний заряд. Гістони з’єднуються з негативно зарядженою дволанцюговою ДНК з утворенням ДНК-гістонового комплексу, стабілізованого силами електростатичного притягання.

Гістони в октамері мають рухливий N-кінце- вий фрагмент із 20 амінокислот, який виступає з нуклеосоми і є важливим для підтримання структури хроматину і контролю за генною експресією. Вони блокують транскрипцію (репресія), тобто не дають використовувати ділянки ДНК як матрицю для копіювання. Дерепресія транскрипції можлива, якщо ослабити зв’язок гістонів із ДНК за допомогою модифікації гістонів, яка змінює їх заряд і конфігурацію. Так, формування хромосом пов’язано з фосфорилуванням гістонів, а посилення транскрипції — з ацетилюванням залишків лізину.

Ацетилювання гістонів — це процес, який по-

чинається в цитоплазмі внаслідок ацетилювання серину з N-кінця гістону Н4 і завершується в ядрі, де ацетилюються переважно бокові радикали залишків лізину. Зрештою ацетилювання приводить до зменшення позитивного заряду гістонів і розпушення комплексів гістон-ДНК.

Фосфорилування-дефосфорилування гістонів

здійснюється в цитоплазмі та ядрі (гідроксильні групи серину і треоніну гістонів Н1, Н3).

Негістонові білки підлягають ковалентній модифікації значно більшою мірою, ніж гістони.

Ацетильні, фосфорні, метильні, глікозильні, АДФ-рибозильні радикали з’єднуються з бокови-

ми ланцюгами амінокислотних залишків у поліпептидних ланцюгах. Протягом різних фаз клітинного циклу закономірності ковалентної модифікації гістонів і негістонових білків можуть бути різними.

Синтез ДНК і S-фаза клітинного циклу

У тваринних клітинах, у тому числі в клітинах людини, реплікація ДНК-геному здійснюється у певний період клітинного (мітотичного) цик-

лу, який називають синтетичним, або S-фазою.

Зазвичай вона відокремлена від мітотичної фази несинтетичними періодами G1 (від англ. gap — проміжок) і G2, які знаходяться до та після S-фази. У тваринних клітин інтервал між мітозами (клітинний цикл) дорівнює приблизно 24 год. За цей час клітина проходить чотири фази життєвого циклу:

—G1-фазу початкового росту, де відбувається синтез мРНК, білків та інших компонентів клітини. У деяких клітин у клітинному циклі

може бути відсутня G1-фаза. Клітини, які пройшли диференціацію і більше не поділяються, по-

стійно знаходяться у фазі спокою G0. За умов стимуляції мітогенезу (факторами росту, онкогенними вірусами) спочиваючі клітини можуть повер-

нутися до стану, який властивий G1. Якщо такі клітини пройдуть критичну точку, вони вступають до S-фази;

—S-фазу — подвоєння молекул ДНК (реплікацію);

—G2-фазу, яка є кінцевим етапом підготовки клітини до поділу;

—М-фазуклітинного поділу (поділ хромосом, клітин).

Сукупність фаз G1, G0, S та G2 носить назву інтерфази. У клітинному циклі інтерфаза змінюється на суттєво коротшу фазу мітозу.

Біохімічні механізми контролю за вступом клітини до мітозу

Регуляція клітинного циклу здійснюється за допомогою ковалентної модифікації (фосфорилування/дефосфорилування) регуляторних білків, які беруть участь у мітозі, наприклад, вхідного до складу хроматину гістону Н1, ламіну (компо-

нента цитоскелета), факторів транскрипції, білків мітотичного веретена і деяких ферментів.

Фосфорилування цих білків запускає процес

мітозу.

Ключовим білком, який регулює вступ клітини до мітозу (G2/M-перехід), є серин-треонін-про- теїнкіназа, яка включає регуляторну субодиницю

— циклін і каталітичну субодиницю — циклін-

залежну кіназу cdk (від англ. cyclin dependent kinase). Молекула будь-якої cdk складається

тільки з однієї субодиниці, яка сама по собі неактивна. Для активації cdk потрібне зв’язування з нею спеціального білка — цикліну. Термін «циклін» відображає той факт, що концентрація циклінів у клітині протягом клітинного циклу змінюється циклічно.

Після завершення мітозу регуляторна субодиниця циклін взаємодіє з убіквітином — низькомолекулярним пептидом, який є універсальним лігандом і «помічає» білки, які підлягають подальшому розщепленню.

Контроль клітинного циклу

Уході клітинного циклу відбувається само-

контроль власного стану. Контролю піддається стан спадкового матеріалу — хромосом. Залежно від результатів, обирається один із трьох варіантів:

— перехід до наступної стадії циклу;

— більш-менш тривала затримка на поточній стадії — для виправлення виявлених дефектів, якщо це можливо;

— запуск механізму апоптозу, якщо виявлені порушення невиправні.

Унормі протягом ембріогенезу і розвитку відбувається швидка проліферація клітин. Вони можуть втрачати свою властивість контролювати клітинний цикл, що призводить до нерегульованого росту клітин, тобто до раку. Гени, чиї продукти беруть участь у регуляції клітинної проліферації, називають протоонкогенами. Мутація цих генів призводить до підвищення неконтрольованої проліферації клітин, отже, прото-

онкоген може стати онкогеном.

Реплікація ДНК

Відповідно до гіпотези Уотсона — Кріка, кожен із ланцюгів подвійної спіралі ДНК є матрицею для реплікації комплементарних дочірніх ланцюгів. Структура подвійної спіралі дозволяє представити простий механізм реплікації ДНК: подвійна спіраль спочатку розкручується, ланцюги розходяться, а потім кожна одноланцюгова половина молекули ДНК добудовується до цілої, дволанцюгової молекули. Наявні нуклеотидні ланцюги є матрицею для синтезу нових ланцюгів; у результаті виходять дві дволанцюгові молекули ДНК, повністю ідентичні вихідній молекулі. Такий спосіб реплікації дістав назву напівконсервативного.

Відзначимо найважливіші особливості реакції.

1.Як субстрати використовуються трифосфати дезоксирибонуклеозидів (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ). У ході реакції від кожного з них відщеплюється пірофосфатний залишок.

2.Реакція йде тільки в присутності вже готової ДНК, що виконує роль матриці. Синтез

нового ланцюга ДНК відбувається в напрямку 5′→ 3′, тобто ДНК-полімераза послідовно приєднує нуклеотиди до 3′-ОН групи одного з ланцюгів «запалу» (або ланцюга РНК). Розрізняють етапи: ініціацію, елонгацію, термінацію.

3.У молекулі ДНК нуклеотидні залишки утворюють пари А=Т і G=C, у реакції витрачаються однакові кількості дАТФ і дТТФ (стехіометричний коефіцієнт m) і однакові кількості дГТФ і дЦТФ (стехіометричний коефіцієнт n).

4.Джерелом енергії в реакції полімеризації мононуклеотидів є енергія, що утворюється при розщепленні пірофосфату за участю пірофосфатази.

5.Необхідна наявність специфічних ферментів: ДНК-залежної РНК-полімерази (праймази), ДНК-полімераз, ДНК-лігази, хеліказ, гіраз, рибонуклеази Н, а також специфічних білків (вони перешкоджають ренатурації, тобто повторному об’єднанню материнських ланцюгів). Весь комплекс ферментів і факторів реплікації називається ДНК-репліказною системою (реплісомою). Особливістю ДНК-репліказної системи є те, що ДНК-полімераза не може синтезувати повністю новий ланцюг ДНК, а може тільки приєднувати дезоксинуклеозидтрифосфати до вже існуючого ланцюга (рис. 12.9).

Ланцюг-матриця (батьківський)

Рис. 12.9. Синтез нового (дочірнього) ланцюга ДНК

Новий («дочірній») ланцюг ДНК утворюється від 3′-ОН групи нуклеотидного ланцюга «запалу» (праймера) — це ланцюг РНК, що складається з 10–60 нуклеотидів, комплементарний ланцюгу ДНК. Синтез праймера здійснюється за допомогою ферменту ДНК-залежної РНК-поліме- рази (праймази).

Ферменти реплікації ДНК у прокаріотів

ДНК-полімераза І каталізує відщеплення праймера і добудовує невеликі фрагменти ланцюга на місцях праймерів.

ДНК-полімераза ІІ бере участь у репарації («ремонтних роботах»), тобто виправляє помилки в ланцюгах ДНК.

ДНК-полімераза ІІІ має 5′→ 3′ полімеразну і

3′→ 5′ нуклеазну активності, тобто синтезує головну частину дочірніх ланцюгів ДНК.

Синтез ДНК на матриці ДНК

ДНК є молекулами з подвійною спіраллю, ланцюги яких антипаралельні, тому реплікації повинен передувати поділ ланцюгів материнської дволанцюгової ДНК.

1.Розкручування подвійної спіралі й утримання двох ланцюгів на деякій відстані один від одного здійснюється за допомогою кількох ферментів і білків:

— ферменти топоізомерази й особливо ДНКгіраза прокаріотів (від англ. gyration — обертання) забезпечують у ланцюгах ДНК розриви водневих зв’язків між полінуклеотидними ланцюгами, що передує їхньому подальшому розкручуванню;

— ферменти хелікази (від англ. helix — спіраль) розплітають короткі ділянки ДНК, утворюючи реплікаційну вилку (від англ. replication — копіювання, fork — вилка) — місце розплітання подвійної спіралі ДНК для утворення нових дочірніх ланцюгів;

— білки, які зв’язують окремі ланцюги ДНК,

—SSB-білки (від англ. single strand binding, proteins), що протидіють їхньому повторному об’єднанню (ренатурації).

Для розкручування ДНК потрібна енергія. На поділ кожної пари основ витрачається енергія гідролізу двох молекул АТФ.

2.Ланцюги у дволанцюговій ДНК антипаралельні (один ланцюг 5′→ 3′, другий — 3′→ 5′),

отже, ріст дочірніх ланцюгів також повинен відбуватися в протилежних напрямках (3′→ 5′ і 5′→ 3′ відповідно). ДНК-полімерази можуть син-

тезувати полідезоксирибонуклеотидний ланцюг у напрямку 5′→ 3′. Тому синтез двох дочірніх ланцюгів ДНК здійснюється за різними механізмами:

— лідируючий (від англ. leading — головний) ланцюг утворюється шляхом безперервно-

го нарощування нуклеотидної послідовності в напрямку 5′→ 3′ за допомогою ДНК-полімера- зи ІІІ;

— відстаючий ланцюг (від англ. lagging — відстаючий) утворюється з окремих фрагментів Оказакі за допомогою ДНК-полімерази ІІІ, кожний з яких починається з відповідного праймера і закінчується перед початком наступного РНК-праймера. Після формування фрагментів Оказакі ДНК-полімераза І вирізає РНК-прай- мер і на його місці синтезує фрагменти ДНК. Розриви між окремими фрагментами Оказакі з’єднуються ДНК-лігазами.