Материал: Біологічна та біоорганічна хімія_Мардашко О.О._ изд. 2008-342 с._ОНМедУ-2012

Н3РО4. При низькому електрохімічному потенціалі цей фермент розщеплює АТФ, енергія використовується для переносу Н+ на зовнішню поверхню внутрішньої мембрани мітохондрій. При високому електрохімічному потенціалі його енергія використовується цим ферментом для синтезу АТФ, тобто F1 і Fо виконують роль АТФ-синте- тази. Отже, тканинним диханням проведена осмотична робота — створення електрохімічного потенціалу, енергія якого виконує хімічну роботу — синтез АТФ, тому теорія дістала назву хеміосмотичної.

Хімічна теорія

Відповідно до цієї теорії спряженість окиснення і фосфорилування забезпечується за рахунок проміжних сполук окиснення і фосфорилування. Ці речовини позначаються Х і В, хімічна природа їх неясна. Схематично цей процес можна зобразити так: відновлений переносник електронів і протонів АН2 взаємодіє з наступним переносником електронів і протонів В за наявності проміжної сполуки Х. У результаті цієї взаємодії відновлюється В до ВН2 і утворюється макроергічний зв’язок між ВН2 і Х (ВН2 ~ Х):

Y ~ Фн + АДФ → АТФ + Y

Далі продукт ВН2~X з’єднується з іншою проміжною сполукою Y, при цьому утворюється Х~Y — проміжна макроергічна сполука. На наступному етапі утворюється сполука Y~Фн, а потім і АТФ.

Механохімічна (конформаційна) теорія Боєра

ються в матрикс через спеціальні пори, минаючи Fо-F1-АТФазу. Вільне окиснення необхідне для утворення тепла й підтримки температури на певному рівні, що має важливе значення при адаптації організму до низьких температур. Вільному окисненню сприяють, тобто роз’єднують дихання і фосфорилування, тироксин, антипіретики (аспірин, фенацетин), антибіотики.

Крім синтезу АТФ і утворення тепла, енергія електрохімічного потенціалу використовується для транспорту іонів Са2+, фосфату й АДФ у матрикс мітохондрій, для транспорту АТФ із матриксу мітохондрій у цитозоль.

Поряд з окисним фосфорилуванням у клітинах перебігає другий тип фосфорилування — субстратне. Воно також супроводжується синтезом макроергів, головним чином АТФ, але не в процесі тканинного дихання, а при перетворенні певних субстратів на продукти ферментативних реакцій, тобто утворюються сполуки, що мають макроергічний карбоксил-фосфатний зв’я- зок, який передається на АДФ з утворенням АТФ. Таким чином, АТФ утворюється за рахунок енергії субстрату, тому цей процес дістав назву субстратне фосфорилування. Реакції субстратного фосфорилування зосереджені переважно у гліколізі (цитозоль), і лише в циклі трикарбонових кислот серед реакцій, які безпосередньо пов’язані з тканинним диханням, існує одна реакція субстратного фосфорилування, неначе «забута» в процесі еволюції:

1. Окиснення гліцеральдегід-3-фосфату до 3- фосфогліцеринової кислоти. При цьому утворюється 1,3-бісфосфогліцерат, що передає фосфат із макроергічним зв’язком на АДФ (гліколіз):

ОН

Сукцинілфосфат Сукцинат

ГТФ + АДФ → АТФ + ГДФ

Однак основним процесом, що забезпечує синтез АТФ, є окисне фосфорилування. У деяких умовах (наприклад, при нестачі кисню й ослабленні тканинного дихання) посилюються процеси гліколізу, тоді роль субстратного фосфорилування, особливо гліколітичного, зростає. У чому полягає біологічне значення субстратного фосфорилування? Чому субстрати обов’язково віддають макроергічну фосфатну групу на нуклеотид? Більшість субстратів-макроергів існують менше секунди, фактично розпадаються в момент утворення. Нуклеотиди (АТФ та ін.) існують близько хвилини, тобто в сотні разів довше, і є більш стійкими акумуляторами енергії, ніж субстрати.

Макроергічні сполуки

Головними макроергічними сполуками є 1,3-бісфосфогліцерат (–49,4 кДж/моль), фосфоенолпіруват (–61,9 кДж/моль), креатинфосфат (–43,1 кДж/моль), ацетил-КоА, АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ та інші, що мають у структурі макроергічні зв’язки, при гідролізі яких виділяється відповідна кількість вільної енергії. Головна біологічна роль серед усіх макроергів належить АТФ. Макроергічними зв’язками в АТФ є зв’язки між першим і другим, а також другим і третім залишками фосфорної кислоти. В організмі дорослої людини одномоментно міститься близько 50 г АТФ; за добу близько 60 кг АТФ синтезується й така ж кількість піддається розпаду. Кожна молекула АТФ розщеплюється і знову регенерується 2,5 тис. разів на добу.

Синтез АТФ

Основна кількість АТФ утворюється в процесі окиснення глюкози. Так, при окисненні 1 моля глюкози до СО2 і Н2О синтезується 38 молекул АТФ. Це відбувається на таких етапах її окиснення:

І. При окисненні 1 молекули глюкози до 2 молекул ацетил-КоА синтезується 14 молекул АТФ:

1) Гліцеральдегід-3-фосфат —→

—→ 3-фосфогліцерат — 4 АТФ

а) гліцеральдегідфосфатдегідрогеназа (НАДН+ Н+) — 3 АТФ

Фосфогліцераткіназа

б) 1,3-бісфосфогліцерат ———————→

———→ 3-фосфогліцерат — 1 АТФ

Піруваткіназа

2) Фосфоенолпіруват —————→

———→ піруват — 1 АТФ

110

8 · 2 = 16 – 2 = 14 АТФ

Оскільки з однієї молекули глюкози утворюється 2 молекули фосфотріоз, то всього синтезується 16 молекул АТФ. Однак дві молекули АТФ витрачаються в процесі фосфорилування глюкози й фруктозо-6-фосфату (утворення глю- козо-6-фосфату й фруктозо-1,6-бісфосфату), тому приріст акумульованої енергії при окисненні глюкози до ацетил-КоА становить 14 молекул АТФ.

ІІ. При окисненні однієї молекули ацетил-КоА в циклі трикарбонових кислот синтезуються 12 молекул АТФ:

Ізоцитратдегідрогеназа

(НАДН + Н+)

1. Ізоцитрат ————————→

————→ Оксалосукцинат — 3 АТФ

Кетоглутаратдегідрогеназа

(НАДН + Н+)

2. α -Кетоглутарат ——————→

———→ сукцинат — 4 АТФ а) α -Кетоглутарат ————→

———→ сукцинілфосфат — 3 АТФ б) сукцинілфосфат ————→

——————→ сукцинат — 1 АТФ

Сукцинатдегідрогеназа (ФАДН2)

3. Сукцинат —————————→

——————→ фумарат — 2 АТФ

Малатдегідрогеназа (НАДН + Н+)

4. Малат ——————————→

——————→ оксалоацетат — 3 АТФ

12 молекул АТФ

З однієї молекули глюкози утворюється 2 молекули ацетил-КоА.

12 · 2=24 молекули АТФ при окисненні 2 молекул ацетил-КоА в ЦТК. Разом 14 + 24=38 молекул АТФ при повному окисненні 1 молекули глюкози до СО2 і Н2О.

38 молекул АТФ утворюється, якщо цитозольний НАДН+Н+, отриманий у процесі гліколізу під дією гліцеральдегідфосфатдегідрогенази, переноситься в мітохондрії за допомогою малатаспартатної човникової системи.

Значна кількість АТФ синтезується також при окисненні вищих жирних кислот. Це відбувається:

1) При кожному циклі β -окиснення вищої жирної кислоти, тобто при відщепленні від останньої молекули ацетил-КоА утворюється 1 моль ФАДН2 (ацил-КоА-дегідрогеназа) і 1 моль НАДН+Н+ (β -оксіацил-КоА-дегідрогеназа). При окисненні ФАДН2 у дихальному ланцюзі синтезуються 2 молекули АТФ, а при окисненні

НАДН+Н+ — 3 молекули АТФ, тобто в сумі утворяться 5 молекул АТФ на кожну відщеплену молекулу ацетил-КоА.

При повному окисненні жирної кислоти, що містить n атомів Карбону, відбувається (Сn/2 – 1) циклів β -окиснення (на один цикл менше, тому що при окисненні бутирил-КоА відразу утворюються 2 молекули ацетил-КоА).

Таким чином, для стеаринової кислоти (С18) буде 18/2 – 1=8 циклів окиснення, що веде до утворення 5 · 8=40 молекул АТФ. Із цієї кількості слід виключити одну молекулу АТФ, витрачену на активацію стеаринової кислоти, тобто утворення ациладенілату. Отже, усього при окисненні стеаринової кислоти до утворення 9 молекул ацетил-КоА синтезується 39 молекул АТФ.

2)При окисненні однієї молекули ацетил-КоА

вЦТК утворюється, як вже зазначалося раніше, 12 молекул АТФ. При окисненні 9 молекул аце- тил-КоА утворюється 9 · 12=108 молекул АТФ.

Загалом при окисненні стеаринової кислоти

до СО2 і Н2О синтезується 39 + 108=147 молекул АТФ. Подібні розрахунки можна зробити й для інших жирних кислот.

Використання молекул АТФ

У більшій частині ферментативних реакцій, в яких АТФ відіграє роль донора фосфату, бере участь активна форма АТФ, тобто комплекс Мg2+AТФ:

- ...

Mg2+

...

O O O

Аденозин O P OP OP O-

O- O- O-

Використання енергії АТФ відбувається кількома шляхами:

1. Ортофосфатний шлях. У багатьох реакціях (наприклад, утворення глюкозо-6-фосфату, фруктозо-1,6-бісфосфату, гліцерол-3-фосфату, для роботи м’язів, транспорту іонів через мембрани проти градієнтів концентрації, здійснення функцій нервової системи й т. ін.) від АТФ відщеплюється тільки один залишок фосфату, тобто ортофосфат, із перетворенням АТФ на АДФ:

АТФ → АДФ + Н3РО4 (при цьому виділяється 30,5 кДж/моль)

2. Пірофосфатний шлях. При цьому від АТФ відщеплюються два залишки фосфорної кислоти, тобто пірофосфат, із перетворенням АТФ на АМФ.

АТФ → АМФ + Н4Р2О7 (виділяється 45,6 кДж/моль)

Це відбувається, наприклад, при активації амінокислот, жирних кислот, тобто при утворенні аміноациладенілатів, ациладенілатів. Пірофосфат під дією пірофосфатази гідролітичним шляхом розщеплюється на 2 ортофосфати:

H4P2O7 + H2O → 2 H3PO4

(при цьому виділяється 19,3 кДж/моль)

Човникові механізми транспорту через мембрану мітохондрій

Основним механізмом тканинного дихання є транспорт ланцюжком ферментів, локалізованих у внутрішній мембрані мітохондрій, на її зовнішню поверхню протонів, у результаті чого зовні формується надлишок протонів, а з боку матриксу накопичуються електрони й, оскільки внутрішня мембрана непроникна для протонів, виникає електрохімічний потенціал, величина якого залежить від активності ферментів тканинного дихання. Надалі протони, проходячи по протонних каналах, забезпечують за участю протонної АТФази утворення АТФ із АДФ і неорганічного фосфату, тобто відбувається окисне фосфорилування. Слід згадати, що всього лише половина енергії, яка вивільняється внаслідок транспорту протонів, акумулюється в макроергічних зв’язках АТФ, а друга половина у вигляді вільного окиснення витрачається на підтримку температури тіла. Таким чином, основним об’єктом тканинного дихання є протони, а основні джерела їх у матриксі мітохондрій — це окиснення вищих жирних кислот і цикл трикарбонових кислот. Саме в цих окисних процесах утворюються відновлені коферменти НАД+ і ФАД, що постачають Гідроген для ферментів тканинного дихання.

Однак у клітині існують окисні процеси, які генерують відновлені коферменти, і перебігають вони не в мітохондріях, а в інших компартментах клітини, наприклад, у цитоплазмі. Типовим представником цитоплазматичного окиснення вуглеводів є гліколіз. Слід підкреслити, що його локалізація в цитоплазмі зумовлена тим, що філогенетично це найстаріший окисний процес, який виник у живих системах, коли на Землі була відсутня атмосфера кисню й, природно, у структурі клітин не було мітохондрій. Разом із тим, у цитоплазмі відсутні механізми, що залучають відновлені коферменти в наступний окисний процес. Водночас мембрана мітохондрій непроникна для відновлених еквівалентів, так само як і для абсолютної більшості метаболітів, що перебувають у цитоплазмі. Виникає проблема, пов’язана з тим, що нагромадження протонів у цитоплазмі, де відсутні механізми їхнього подальшого використання, приведе до закиснення й зниження рН середовища, що впливає на функцію численних ферментних систем (оскільки існує залежність активності ферментів від рН середовища). Отже, нагромадження протонів у цитоплазмі спричинює погіршення функції клітини, й тому їх потрібно видалити з цитоплазми, але самостійно протони не можуть проникнути через мембрану всередину мітохондрій, де вони необхідні для системи тканинного дихання. Отже, повинні існувати механізми транспорту протонів із цитоплазми до мітохондрій — такі човникові механізми існують.

Гліколіз — це каскад послідовних реакцій, спрямованих на анаеробне окиснення глюкози. Особливо важлива друга частина гліколізу, що починається з окиснення гліцеральдегід-3-фосфа-

ту. Гліцеральдегідфосфатдегідрогеназа містить як кофермент окиснений НАД+. У ході реакції НАД+ відновлюється до НАДН+Н+. Для того, щоб молекула коферменту могла брати участь у наступних реакціях, необхідна реакція, у якій би брав участь відновлений НАД+. Така реакція в гліколізі існує — це лактатдегідрогеназна реакція. У ній піруват за допомогою лактатдегідрогенази й НАДН відновлюється в лактат. Відомо, що кофермент з’єднується з апоферментом тільки під час реакції, а потім цей комплекс дисоціює. Тому окиснена форма НАД+ з’єднується з білковою частиною гліцеральдегідфосфатдегідрогенази, бере участь в окисненні гліцеральдегід-3- фосфату, перетворюється на відновлену форму, від’єднується від апоферменту й переходить до апоферменту лактатдегідрогенази, бере участь у відновленні пірувату в лактат, при цьому окиснюється й знову переходить до складу гліцеральдегідфосфатдегідрогенази.

Таким чином, на заключному етапі гліколізу формується тандем, який складається з двох оксидоредуктаз, що використовують окиснену й відновлену форму одного коферменту. Даний процес дістав назву гліколітичної оксидоредукції,

біологічний зміст якої полягає в підтримці етапу гліколізу, що починається з фосфотріоз. Слід підкреслити, що саме на цьому етапі вивільняється енергія вуглеводів, що, завдяки реакціям субстратного фосфорилування, резервується в макроергічних зв’язках АТФ (1,3-бісфосфогліцерино- ва та фосфоенолпіровиноградна кислоти). Оскільки зазначені реакції перебігають в анаеробних умовах, то кінцевим продуктом є лактат, що, накопичуючись у цитоплазмі, змінює рН клітини. Висока спорідненість лактатдегідрогенази до відновленої форми коферменту зумовлена ізоферментним спектром ЛДГ, що в анаеробних умовах характеризується високим вмістом ізоферментів ЛДГ5 і ЛДГ4. Енергетичний ефект окиснення 1 молекули глюкози в анаеробних умовах до молочної кислоти досягає 2 молекул АТФ (4 молекули АТФ, отриманих у реакціях субстратного фосфорилувания, і 2 молекули АТФ, витрачених у гексокіназній і фосфофруктокіназній реакціях).

Інша ситуація у разі аеробних умов. У присутності кисню спорідненість лактатдегідрогенази до відновленої форми коферменту зменшується, оскільки в клітинах збільшується вміст ізоферментів ЛДГ1 і ЛДГ2, які інгібуються низькими концентраціями пірувату, утворення лактату не відбувається і відновлений кофермент НАДН+Н+ у цій реакції не використовується. Але всі реакції гліколізу до етапу перетворення пірувату на лактат відбуваються і в аеробних умовах. У якій же реакції відбувається використання відновленого коферменту НАД+, утвореного в гліцеральдегідфосфатдегідрогеназній реакції? Виявляється, що в цитоплазмі клітин функціонує НАД+-залежна малатдегідрогеназа, що каталізує реакцію відновлення цитоплазматичного оксалоацетату в малат із використанням відновленого коферменту НАД+. Спорідненість апоферменту малатдегідрогенази до коферменту збільшується в при-

сутності кисню, що зумовлено її ізоферментним спектром. Таким чином, відновлений НАД+ із гліцеральдегідфосфатдегідрогеназної реакції не бере участі в утворенні лактату, а бере участь в утворенні малату в малатдегідрогеназній реакції. В аеробних умовах створюється тандем між гліцеральдегідфосфатдегідрогеназою і малатдегідрогеназою — забезпечується підтримка функціонування другого етапу гліколізу.

Характерною рисою малату є те, що він має здатність проникати з цитоплазми через мембрану мітохондрій у матрикс, де бере участь у циклі трикарбонових кислот. Але тут малат за участю мітохондріальної НАД+-залежної малатдегідрогенази окиснюється до оксалооцту з перетворенням окисненої форми НАД+ на відновлену. Таким чином, нуклеотидний пул цитоплазматичних і мітохондріальних нікотинамідних нуклеотидів не змінюється, а транспорт протонів здійснюється завдяки взаємоперетворенню оксалоацетату на малат і малату — на оксалоацетат, а також здатністю малату переходити з цитоплазми в мітохондрії.

Виникає питання: як з’являється оксалоацетат у цитоплазмі клітин? Адже він утворюється в мітохондріях або шляхом карбоксилювання пірувату, або шляхом окиснення малату в циклі трикарбонових кислот, водночас оксалоацетат не здатний виходити з мітохондрій у цитоплазму. Його поява в цитоплазмі клітин пояснюється тим, що аміак може проходити через мембрану мітохондрій у матрикс і тут бере участь у перших реакціях циклу синтезу сечовини або в реакціях трансамінування, зокрема, у перетворенні оксалоацетату на аспартат під дією мітохондріальної аспартатамінотрансферази з використанням глутамату.

Аспартат має здатність проникати через мембрану мітохондрій у цитоплазму, й тут під дією цитоплазматичної аспартатамінотрансферази, але вже у зворотному напрямку, аспартат трансамінується в оксалоацетат. Кетоглутарат, що утворюється в мітохондріях в аспартатамінотрансферазній реакції, або бере участь у циклі трикарбонових кислот, або виходить через мембрану мітохондрій у цитоплазму й бере участь у реакції, що каталізує цитоплазматична аспартатамінотрансфераза у напрямку аспартат — оксалоацетат. Формується так званий малатаспартатний човниковий механізм, спрямований на перенос протонів із цитоплазми в мітохондрії й залучення їх у систему тканинного дихання. Завдяки існуванню малатаспартатного човникового механізму в аеробних умовах різко змінюється біоенергетика окиснення глюкози. Відновлений НАДН із цитоплазми переміщається в мітохондрії й у системі тканинного дихання утворює 3 мол. АТФ. У зв’язку з тим, що лактат не утворюється, піруват проникає всередину мітохондрій, піддається окисному декарбоксилюванню за участю піруватдегідрогеназного комплексу з утворенням ще однієї молекули відновленого НАДН, що дає в системі тканинного дихання ще 3 мол. АТФ. Виникаючий при цьому ацетил-КоА піддається окисненню в циклі три-