Материал: А27483 Красникова ЛВ Кострова ИЕ Машкин ДВ Микробиология производства хлеба кондит и макарон изделий

7 АДФ

ГЛИЦЕРИН + Ф_н АТФ

3-фосфоглицериновая кислота

8

2- фосфоглицериновая кислота

9 – Н₂О

Фосфоенолпируват

АДФ

10 АТФ

Пируват

11 СО₂

Ацетальдегид

12 НАДН+Н⁺

НАД⁺

ЭТАНОЛ

Рис. 1.5. Ферменты, участвующие в осуществлении спиртового брожения (Шлегель, 1987):

1 – гексокиназа; 2 – глюкозофосфатизомераза; 3 – фосфофруктокиназа; 4 – фрукто-

зо-1,6-дифосфат-альдолаза; 5 – триозофосфатизомераза; 6 – 3-фосфоглицеральдегид-дегидрогеназа; 7 – фосфоглицераткиназа; 8 – фосфоглицеромутаза; 9 – енолаза; 10 – пируваткиназа; 11 – пируватдекарбоксилаза; 12 – алкогольдегидрогеназа; 13 – глицерол-3-фосфатдегидрогеназа; 14 – глицеролфосфатаза

Сбраживание глюкозы до этанола и СО₂ обычно происходит в слабокислой среде (рН 3–6). Если спиртовое брожение проводить в щелочной среде (например, в присутствии NaHCO₃), то также происходит накопление глицерина. Это объясняется тем, что ацетальдегид в щелочных условиях не может являться акцептором водорода окисляемого субстрата, поскольку участвует в реакции дисмутации с образованием этанола и уксусной кислоты. Поэтому акцептором электронов, как и в предыдущем случае, служит диоксиацетонфосфат. Процесс брожения в щелочной среде называют смешанной формой спиртового брожения, которую можно представить в виде уравнения

2 С₆Н₁₂О₆ → 2 С₃Н₈О₃ + С₂Н₅ОН + СН₃СООН + 2 СО₂

глюкоза глицерин этанол уксусная диоксид

кислота углерода

На интенсивность спиртового брожения влияет ряд факторов: температура и влажность теста; наличие витаминов и минеральных веществ, необходимых для нормальной жизнедеятельности дрожжей; бродильная активность дрожжей; состав рецептуры; интенсивность замеса теста; присутствие в тесте улучшителей (ферментных препаратов).

При изучении спиртового брожения Л. Пастер открыл, что в условиях свободного доступа кислорода воздуха брожение подавляется и активируется дыхание. Это явление получило название эффекта Пастера. Эффект Пастера объясняется взаимодействием различных энергетических путей, существующих у дрожжей, а именно, конкуренцией за АДФ между процессами субстратного фосфорилирования гликолитического пути и окислительного фосфорилирования в дыхательной цепи.

1.2. Молочнокислые бактерии

1.2.1. Характеристика молочнокислых бактерий, используемых в хлебопекарном производстве

Молочнокислые бактерии, относящиеся к роду Lactobacillus cемейства Lactobacillaceae, являются постоянными спутниками хлебопекарного производства. Еще в 1987 г. М.Ф. Попов показал, что в ржаных заквасках присутствуют не только дрожжи, но и специфические бактерии, способные разрыхлять тесто и накапливать в нем кислоту благодаря газообразующей и кислотообразующей способности. Холлигер в 1902 г. обнаружил в ржаных заквасках и тесте три различных типа негазообразующих бактерий – продуцентов молочной кислоты. Автор видел роль этих бактерий не только в том, что они продуцировали кислоту в тесте, но и в их антагонистическом действии на посторонние микроорганизмы, вносимые с мукой: гнилостные, маслянокислые, уксуснокислые. Геннеберг в 1909 г. впервые представил сведения об участии в брожении кислого теста гетероферментативных молочнокислых бактерий и считал, что брожение теста происходит за счет жизнедеятельности как дрожжей, так и бактерий. Датский ученый Кнудсен (1924 г.) из большого количества заквасок кислого теста выделил молочнокислые бактерии, которые разделил на две группы – А и В. К группе А автор отнес гомоферментативные бактерии Streptobacterium plantarum, а к группе В – представителей подгруппы бетабактерий, образующих помимо молочной кислоты значительное количество других продуктов, главным образом летучих кислот.

Русский ученый В.Л. Омелянский, изучавший в 1924 г. самопроизвольное брожение теста, подтвердил, что этот процесс происходит в результате жизнедеятельности специфических газообразующих бактерий, характерных для микрофлоры муки. Он показал, что эти микроорганизмы могут служить в качестве закваски для поднятия ржаного теста.

Вопрос об использовании чистых культур бактерий кислого теста для приготовления заквасок в нашей стране был поставлен в начале 20-х гг., исходя из того, что применение таких заквасок предотвратит нежелательное влияние посторонней микрофлоры муки на процесс брожения и позволит использовать выделенные штаммы в заданных количествах.

Создание заквасок для пшеничного и ржаного теста на чистых культурах дрожжей и молочнокислых бактерий способствовало интенсификации процесса приготовления хлеба и улучшению качества готовой продукции.

Молочнокислые бактерии объединены в одну группу по способности накапливать в качестве основного продукта брожения молочную кислоту. Они широко распространены в природе: встречаются в почве, на поверхности растений, в растительных, мясных и молочных продуктах, кишечнике человека и животных.

Молочнокислые бактерии растут при оптимальном значении рН 6,5–6,8. Однако они являются кислотоустойчивыми и в полуфабрикатах хлебопекарного производства выдерживают рН 3,0–3,5. Характерным свойством молочнокислых бактерий является их спиртоустойчивость. Они способны размножаться при высоких концентрациях этанола - 18–24 об. %. Рост молочнокислых бактерий ингибируют высокая концентрация сахара (свыше 10 %), хлорида натрия (свыше 3 %), а также накапливающиеся при брожении молочная и уксусная кислоты.

При росте в жидкой среде молочнокислые бактерии образуют равномерную муть и небольшой осадок. На поверхности агаризованной среды молочнокислые бактерии формируют мелкие гладкие блестящие колонии со сферической поверхностью серовато-белого цвета (S-тип, от англ. smoot – гладкий). В некоторых случаях наблюдаются звездчатые или волокнистые колонии, врастающие в субстрат (R-тип, от англ. rough – шероховатый). Гораздо реже встречаются слизистые колонии (О-тип). Глубинные колонии имеют вид чечевицы или треугольника.

Лактобациллы представляют собой прямые палочки разных размеров - от коротких (2–5 мкм) до длинных (12–15 мкм) и толщиной 0,5–1,0 мкм с закругленными или обрубленными концами.

Молочнокислые бактерии, как правило, неподвижны, грамположительны, не образуют спор (за редким исключением), не продуцируют пигментов, не восстанавливают нитраты в нитриты, не образуют индол и сероводород, желатину не разжижают. Размножаются, как и большинство бактерий, простым делением.

Температурные пределы роста 20–53 °С, оптимальная температура - 30–45 °С.

По отношению к кислороду воздуха молочнокислые бактерии являются факультативными анаэробами. Они не способны синтезировать АТФ за счет дыхания, что отражает отсутствие у них цитохромов и других гемсодержащих ферментов.

Молочнокислые бактерии лишены фермента каталазы, расщепляющего пероксид водорода на воду и молекулярный кислород. Эту функцию у них выполняет фермент пероксидаза.

Отсутствие каталазной активности является одним из диагностических признаков молочнокислых бактерий, поскольку они представляют собой фактически единственный вид бактерий, лишенных каталазы, но способных расти в присутствии кислорода воздуха.

Молочнокислые бактерии очень требовательны к источникам питания; им необходимы витамины, значительное количество аминокислот. Установлено, что в питательной среде должны содержаться пантотеновая и никотиновая кислоты, рибофлавин, пиридоксин, биотин и фолиевая кислота. Из углеводов они преимущественно сбраживают гексозы и, гораздо реже, пентозы. В зависимости от метаболической активности молочнокислые бактерии разделяют на гомоферментативные и гетероферментативные. Первые образуют при ферментации сахаров до 95 % молочной кислоты и ничтожное количество побочных продуктов. Вторые, наряду с молочной кислотой, накапливающейся в количестве 60-70 %, образуют этанол, уксусную и муравьиную кислоты, диоксид углерода.

Следует отметить, что границы между гомо- и гетероферментативным типами брожения в известной степени условны и могут варьироваться при изменении окислительно-восстановительного потенциала среды. В девятом издании определителя бактерий Берджи лактобациллы объединены в семейство Lactobacillaceae, род Lactobacillus, который подразделен на три группы:

1 - облигатно-гомоферментативные лактобациллы, расщепляющие гексозы до молочной кислоты по гликолитическому пути Эмб-дена–Мейергофа–Парнаса, но не способные сбраживать пентозы.

2 - факультативно-гетероферментативные лактобациллы, способные сбраживать гексозы с образованием молочной кислоты по этому же пути и способные ферментировать пентозы с образованием молочной и уксусной кислот;

3 - облигатно-гетероферментативные лактобациллы, сбраживающие гексозы и пентозы по пентозофосфатному пути с образованием молочной, уксусной кислот и диоксида углерода. Согласно классификации, предложенной в 60-х гг. ХХ в. Рогозой (M. Rogosa) и Шарп (M. Sharhe), в пределах рода выделены три подгруппы: термобактерии (Thermobacterium), стрептобактерии (Streptobacterium) и бетабактерии (Betabacterium).

На рис. 1.6 показана систематика лактобацилл, наиболее часто используемых в хлебопекарной промышленности.

Семейство Lactobacillaceae

Род Lactobacillus

Подроды

Thermobacterium Streptobacterium Betabacterium

Облигатно- гомофермен- тативные

L. delbrueckii L. сasei L. brevis

L. plantarum L. fermentum

L. buchneri

L. sanfrancisсo

Рис. 1.6. Систематика лактобацилл

К первой группе относятся термофильные лактобациллы, образующие в процессе брожения преимущественно молочную кислоту – облигатно-гомоферментативные – и имеющие температурный оптимум в диапазоне 40–60 °С.

Вторая группа лактобацилл гексозы сбраживает с образованием главным образом молочной кислоты, а пентозы – с образованием молочной кислоты, диоксида углерода и этанола, в связи с чем ее относят к факультативно-гетероферментативным молочнокислым бактериям. Молочнокислые палочки, входящие в эту группу, часто соединены в цепочки, за что и получили название стрептобактерий, их оптимальная температура роста 25–30 °С.

В третью группу входят облигатно-гетероферментативные лактобациллы, продуктами брожения которых являются молочная кис-лота, этанол, диоксид углерода, а также большое количество летучих кислот. Температурный оптимум лактобацилл этой группы 25–30 °С.

L. delbrueckii. Вид получил название по имени немецкого бактериолога Дельбрюка. Этот вид включает три подвида, которые прежде определялись как четыре разных вида: L. delbrueckii, L. bulgaricum, L. lactis и L. leichmanii. В настоящее время установлено, что эти виды имеют гомологию ДНК более чем на 80 %, поэтому прежние виды переведены в ранг следующих подвидов: L. delbrueckii subsp. delbrueckii, L. delbrueckii subsp. bulgaricum и L. delbrueckii subsp. lactis. Клетки имеют вид крупных палочек с закругленными концами размером (5–9)(0,5–0,8) мкм, расположенных одиночно или попарно.

Палочка Дельбрюка размножается при оптимальной температуре 45–50 °С. Сбраживает глюкозу, галактозу, мальтозу, сахарозу с образованием D-изомера молочной кислоты, газ не образует. Требовательна к присутствию в среде источников азота и витаминов. Используется при получении жидких дрожжей.

L. сasei. Этот вид имеет четыре подвида: L. casei subsp. casei, L. casei subsp. pseudoplantarum, L. casei subsp. tolerans и L. casei subsp. rhamnosus. Последний подвид может быть выделен в отдельный вид. Клетки имеют вид палочек с прямоугольными концами, располагающихся чаще всего цепочками. Размер клеток (2–4)(0,7–1,1) мкм. Штаммы этого вида образуют L-изомер молочной кислоты. Оптимальная температура роста 30–32 °С, отдельные штаммы могут расти при более высокой температуре (38±2) °С. Лактобактерии этого вида обнаружены в заквасках и принимают активное участие в брожении теста.

L. plantarum. Клетки этого вида представляют собой палочки размером (3–8)(0,9–1,2) мкм. Сбраживает углеводы с образованием DL-изомеров молочной кислоты. L. plantarum продуцирует антибиотик лактолин, подавляющий кишечные палочки и споровые формы бактерий. Оптимальная температура роста около 30 °С. Палочка plantarum постоянно встречается в заквасках, участвуя в брожении теста.

L. brevis. Палочки с закругленными концами размером (2–4)(0,7–1,0) мкм, располагаются одиночно или цепочками разной длины. Вызывает гетероферментативное молочнокислое брожение, образуя при этом DL-изомеры молочной кислоты. Этот вид специфичен для заквасок. За счет накопления летучих кислот при брожении придает готовому хлебу определенный аромат.