Материал: Polioxialkanoaty_POA__biorazrushaemye_polimery_dlya_meditsiny

высокие выходы продукта, до 200 г/л (Lee, 1996c). Процесс хорошо иллюстрируется следующими уравнениями:

где, соответственно, X, P, R – концентрация клеток, ПОБ и остаточ-

ных клеток; f – функция содержания ПОБ, и Pmax, Xmax, fmax – максимально достижимые значения концентрации ПОБ, клеток и содер-

жания ПОБ.

Важным моментом является время прекращения процесса ферментации. В большинстве случаев ферментация может быть остановлена при максимальных значениях концентрации полимера, но это скажется на снижении общей продуктивности. Увеличение длительности ферментационного цикла обеспечивает увеличение концентрации полимера с незначительным уменьшением продуктивности вследствие возникновения некоторых проблем по выделению и очистке полимера.

Теоретически непрерывное культивирование должно обеспечить наивысшую продуктивность. Однако, только с бактериями Al. latus и Ps. oleovorans получены удовлетворительные результаты продукции ПОА в проточном режиме (Preusting et al., 1992; 1993). Состояние steady-state в культуре Al. latus на фруктозе достигнуто при уровне ПОБ в 16 г/л при продуктивности, равной 2.5 г/л ч. В культуре Ps. oleovorans на октане в качестве источника углерода (15 % об.), при лимите азота в среднем изменение скорости протока от 0.09 до 0.46 ч–1 сопровождалось снижением концентрации биомассы и ПОБ, соответственно, с 2.25 г/л и 46.7 % до 1.32 г/л и 8.3 %. В состоянии steady-state концентрация ПОБ составила 11.6 г/л, продуктивность – 0.58 г/л ч.

По математическому моделированию динамики биосинтеза полиоксиалканоатов бактериями опубликовано немного работ (Yoon et al., 1994; Lee J.H. et al., 1997; Katoh et al., 1999). Существенный инте-

рес представляет последняя работа (Katoh et al., 1999), в которой построена модель биосинтеза поли- -оксибутирата (Q) из молочной кислоты (S) при лимитировании роста бактерий по азоту, где кроме лимитирования по азоту учитывалось субстратное ингибирование

95

роста бактерий лактатом (S, N), записанное в виде зависимости Бриггса–Холдейна.

Следует отметить, что такой вид зависимости весьма перспективен и для описания биосинтеза полиоксиалканоатов различными бактериями на разнообразных, в том числе токсичных субстратах (например, октане). В данной модели рассматривается также, что микроорганизмы накапливает поли- -оксибутират внутри клетки в ответ на лимитирование по азоту. Однако такая модель несовершенна, поскольку при голодании по азоту останавливается рост клеток, а не биосинтез полигидроксибутирата. Авторы попытались обойти эту трудность, прибегнув к детальному рассмотрению метаболических потоков в клетке, происходящих в биохимических путях синтеза полиоксиалканоатов с учетом различного соотношения C/N. Такой подход позволил также оценить величину целого ряда коэффициентов модели. Было обнаружено явное несоответствие расчетных данных и параметров биосинтеза, полученных в эксперименте, которое было отнесено на счет сложности динамической системы смешанной культуры.

К настоящему времени разрабатываются также и проходят экспериментальную проверку и структурированные модели процессов биосинтеза полиоксиалканоатов бактериями, из которых наиболее основательной является работа (Grobe-Uhlmann and Bley, 1999). Авторы работы развивают весьма перспективный подход к описанию биосинтеза внутриклеточного полимера, основанный на известной модели Шапи с соавторами, в которой бактериальные клетки представлены как структурированные системы, содержащие два компартмента – остаточную массу внутриклеточных макромолекул и, собственно, полимер (Snape et al., 1995). Полагается, что биомасса бактерий содержит два главных компонента: метаболически активную часть, называемую остаточной биомассой, и метаболически неактивную часть – внутриклеточный полимер (ПОБ). Во время фазы роста лимитирующий субстрат (азот) расходуется на синтез белка, при исчерпании субстрата синтез белка останавливается, а синтез полимера в клетках активизируется. В этой модели учитывается также ингибирование роста субстратом и процессы, участвующие в биосинтезе и аккумуляции полимера в клетках.

Для поиска кинетических коэффициентов процессов биосинтеза полиоксиалканоатов в культуре микроорганизмов с привязкой их к конкретным условиям управляемого культивирования авторы работы применили широко известные методы фильтров Калмана и Гаусса. В то же время, в этой и других работах отмечаются и недостатки существующих моделей процессов биосинтеза полиоксиалканоатов культурами микроорганизмов, в том числе и водородокисляющих бактерий. Отмечается, что удовлетворительных моделей роста культур

96

микроорганизмов и аккумуляции полиоксиалканоатов в клетках с построением теории метаболического контроля перехода клеток из фазы роста в фазу синтеза и аккумуляции полимера на целом ряде перспективных для промышленного применения субстратов пока не предложено.

Экспериментально исследуются двухстадийные хемостатные режимы, однако имеющиеся результаты пока не очень обнадеживают. Недавно исследован процесс накопления ПОБ в двухстадийной проточной культуре Al. eutrophus (Lee, 1996a, b). Оптимизация режима обеспечила получение во втором аппарате следующих показателей процесса по концентрации биомассы клеток и полимера, соответственно, до 75 и 44.8 г/л (при скорости разбавления 0.064 ч.–1). Продуктивность получения полимера составила 2.86 г/л/ч. Продуктивность в двустадийном хемостате в целом была в 1.7 раза выше по сравнению с одностадийным режимом. Некоторые перспективы, вытекающие из проточных режимов, ограничивают пока широкое их использование из-за сопутствующих технологических проблем, а именно, нестабильности процесса и контаминации. Однако некоторые культуры микроорганизмов, в том числе рекомбинантные, у которых быстрый рост ассоциирован с суперпродукцией ПОА, являются перспективными кандидатами для проточного выращивания. Для этого требуются дальнейшие исследования, направленные на оптимизацию процесса культивирования бактерий как по выходу полимера, так и по общей продуктивности процесса и технико-эко–но–миче– ский анализ возможных вариантов.

Тип используемого для получения полиоксиалканоатов сырья определяется исходя из физиолого-биохимических свойств микроор- ганизмов-продуцентов и экономической целесообразности выбранной стратегии, а также области применения готовой продукции. В связи с тем, что ПОА перспективны для применения в медицине, фармакологии, пищевой промышленности, сельском и коммунальном хозяйстве, масштабы производств полимеров могут быть самыми разными, от малотоннажных в десятки килограммов (для медицины и фармакологии), до десятков тонн в год и более. Таким образом, требования, выдвигаемые к качеству и стоимости сырья, для различных объемов производств и областей применения, также различны. Сырьем для получения ПОА могут быть самые разные субстраты, обладающие различной степенью восстановленности, энергосодержанием и, конечно, стоимостью (таблица 2.5). В этом списке – индивидуальные соединения (сахара различной природы, спирты, кислоты, углекислота, углеводороды), а также комплексные субстраты, включающие отходы различных промышленных и сельскохозяйственных производств.

97

Таблица 2.5 Затраты и стоимость сырья для синтеза полиоксибутирата

(Collins, 1987; Lee, 1996)

В связи с тем, что значительная доля стоимости ПОА приходится на долю исходного сырья, магистральное направление исследований, определяющее стратегию промышленного производства полиоксиалканоатов, в настоящее время связано с возможностями расширения сырьевой базы. Поэтому в последнее время активизированы работы, ориентированные на поиск новых субстратов и расширение сырьевой базы. При этом исследуется рост и синтез ПОА как уже известными и изученными микробными штаммами с привлечением новых субстратов, а также продолжается поиск новых природных и конструирование новых штаммов, способных эффективно усваивать новые субстраты.

Биосинтетический путь образования полиоксибутирата в бактериях в общем виде можно представить следующей реакцией:

2 ацетил-КоА + НАД(Ф)Н + ПОБn НАД(Ф)+ + 2КоАSН + ПОБn + 1

Сахара рассматриваются в качестве субстрата для синтеза полиоксиалканоатов различными микроорганизмами, в том числе водородными бактериями Alcaligenes eutrophus и A. latus. Природные штаммы данных микроорганизмов из спектра сахаров используют, как известно, только фруктозу. Однако легко получаемые мутантные штаммы утилизируют также глюкозу и сахарозу, включая их по пути Дудорова–Этнера. Синтез полиоксибутирата по данному пути выглядит следующим образом (Collins, 1987):

ПОБ + глюкоза + АДФ + Рi + НАД+ ПОБn + 1 + АТФ + 3НАДН + 2СО2

98

Теоретически возможны затраты сахаров на образование полимера около 2.5 г/г; однако реальные затраты, например, в производстве ICI составляют до 3.0–3.3 г/г ПОБ.

Мутантные штаммы E. coli с интродуцированной генетической системой синтеза ПОА из A. eutrophus также культивируют на средах с глюкозой в качестве источника углеродного питания. В данном случае в состав сред входят различные органические добавки и стимуляторы, без которых культивирование трансгенных штаммов не представляется возможным. В принципе на сахарах реализованы процессы различной степени интенсивности и масштаба (таблица 2.6).

Субстратом для синтеза полиоксибутирата у метилотрофов служит метанол, обеспечивающий высокие общие урожаи биомассы (таблица 2.7).

Описан синтез ПОБ у факультативных метилотрофов с сериновым путем с участием пируват дегидрогеназы для образования ацетил -КоА. Последний может также образовываться через фосфоглицерат, но альтернативный путь менее энергетически эффективен:

2СН2О + 2НАДН + 2АТФ + КоАSН ацетилКоА +2НАД+ +2АДФ + 2Рi.

Суммарная реакция синтеза полиоксибутирата на метаноле выглядит следующим образом:

ПОБn + 2СН2О + 2СО2 + 5НАД(Ф)Н + 4АТФ ПОБn + 1 + НАД(Ф)+ 4АДФ + 4Pi.

Таблица 2.6 Показатели микробиологических процессов получения ПОА

(Bourque et al., 1995; Ryu et al., 1997)

Таблица 2.7 Показатели продуктивности процесса биосинтеза и выхода ПОА на метаноле

(Bourge et al., 1992; Lee, 1996)

99