сельскохозяйственные культуры растений могут оказаться выгодными для получения ПОА (Williams, Peoples, 1996с). В этой связи развернуты исследования по переносу системы синтеза ПОА в дрожжи, высшие растения, клетки насекомых.
В отличие от кишечной палочки, в которую необходима интродукция всей системы синтеза полиоксиалканоатов, для синтеза ПОА в дрожжах нужно экспрессировать только часть этой системы. Так, при интродукции генов ПОБ-полимеразы из Alcaligenes в дрожжевые клетки, в последних зарегистрировано образование гранул полиоксибутирата, однако выходы его были низкими, около 0.5 % к весу клеток (Leaf et al., 1996; 1996). Такой низкий уровень биосинтеза ПОБ можно объяснить, видимо, недостаточной активностью эндогенной кетоацил-КоА тиолазы и ацетацетил-КоА редуктазы в дрожжах (соответственно, определены как 150 и 200 нМ/мин./мг). Последующие работы, вероятно, смогут улучшить эти результаты.
Экспрессия phbC генов R. eutropha в клетках Trichoplusia впервые получена с использованием бакуловирусной системы переноса генов. Успешная экспрессия генов получена спустя 60 часов после вирусного заражения; при этом 50 % от общего белка составила ПОБ-деполимераза (Williams et al., 1996a). Другая работа была направлена на получение трансгенных клеток Spodeptera frugiperda (гусеница паданицы), в которые интродуцировали синтазу жирных кислот крысы трансфекцией с помощью бакуловирусов (Williams et al., 1996b). Далее, в результате последующей трансфекции в клетки была интродуцирована полимераза из R. еutropha. В результате в клетках насекомых синтезировались гранулы полиоксибутирата, что было подтверждено иммунофлюоресцентным анализом (Joshi, Smith, 1993). Уровень синтеза ПОБ составил около 1 мг/ л культуры клеток (0.16 % к весу сухого вещества). Эти результаты показывают принципиальную возможность использования эукариотических ферментов для образования ПОБ-интермедиатов и получения экспрессии phb генов в гетерологичном хозяине (Williams et al., 1996b).
Недавно проведены успешные работы по клонированию и экспрессии бактериальных генов синтеза полиоксиалканоатов в высших растениях. Стабильная экспрессия phb обеспечила синтез в Arabidopsis высокомолекулярного (1 000 000 Da) полиоксибутирата (Poierier et al.,1995). В отличие от бактерий эукариотические клетки характеризуются высокой компартментализацией, и это отражается на количестве экспрессируемых phb генов. Данные гены должны соотноситься с растительными клетками, когда концентрация ацетилКоА – наивысшая, и рост растения не ограничен.
Arabidopsis был первой растительной моделью, использованной для изучения возможности гетерологичной экспрессии phb генов микроорганизмов. Для синтеза ПОА в растениях необходимо интро-
90
дуцировать в них только гены, контролирующие синтез редуктазы и ПОА-синтазы, так как кетотиолаза – первый ключевой фермент системы синтеза ПОА, присутствует в цитоплазме клеток высших растений (Poirier et al., 1992). После интродукции в Arabidopsis thaliana генов phbB и phbC из R. eutropha, в цитоплазме, ядре и клеточных вакуолях обнаружили синтез гранул полиоксибутирата. Диаметр гранул составлял от 0.2 до 0.5 нм, однако, суммарная концентрация полимера было низкой, около 100 мг/г сырого веса. Вероятно, в растениях критическим местом для синтеза ПОА является тиолазная активность. Синтез гранул ПОБ в ядре также вредит росту и развитию растения (Poirier et al., 1992).
Более продуктивная трансгенная форма Arabidopsis thaliana получена в результате интродукции генов phbB и phbC из R. eutropha в пластиды. В этих органеллах активность ацетил-КоА, необходимой для данного синтеза, существенно выше по сравнению с ядром и вакуолями. В результате продукция ПОБ была существенно выше, до 14 % к весу сухого вещества, и его молекулярная масса достигала 500 000 Da (Nawrath, Poirler, 1996). Этот результат свидетельствует о том, что получение полиоксиалканоатов с использованием высших растений может стать экономически выгодным.
ПОБ-синтезирующая система экспрессирована в культуре клеток кукурузы (сорт Черный мексиканский Zea may). Клетки росли в биореакторе быстрее по сравнению с полностью дифференцированным растением. Тиолазная активность в них стабилизировалась на уровне 0.140 ед./мг, однако редуктазная активность была менее стабильна и падала от 0.64 до 0.12 ед./мг. В молодой культуре phbB гены детектировались, однако в процессе культивирования их становилось значительно меньше. В дополнение к нестабильности phbB и phbC генов трансформированные растительные клетки росли мед-
леннее, чем исходные (Hahn et al., 1997).
Недавно phb гены Alcaligenes были интродуцированы в Gossyprium hirsutum и было установлено, что в волокнах хлопчатника происходит синтез полиоксибутирата. Конструкция, содержащая phbB и phbCb гены, была встроена в клетки волокон; экспрессия наблюдалась в молодых волокнах на стадии развития растения (10–15 день после встраивания) под контролем Е6 промотора или в старых волокнах, на 35–40 день, когда гены контролировались EbL2A промотором. Уровень активности эндогенной тиолазы лежал в диапазоне 0.01–0.03 mM/мин./мг, редуктазной активности – между 0.07– 0.52 mM/мин./мг. Наличие гранул полимера в волокнах хлопчатника, как оказалось, привело к улучшению фотосинтетических свойств растения (Chowdhury, John, 1998). Возможно, этим открывается путь модификации свойств волокон хлопчатника, включая их способность к окрашиванию, теплопроводность, деформируемость. Максимум
91
содержания ПОБ в волокнах, однако, составил всего около 3.4 мг/г сухого веса волокон.
Эти результаты открывают дорогу для будущего индустриального применения растений для получения биопластиков. Фотосинтетическая продукция ПОА на естественном свету может оказаться намного выгоднее по сравнению с энергоемким микробным синтезом. Кроме этого, появляется возможность влиять на свойства растительных тканей.
Таким образом, имеющееся разнообразие микроорганизмов, аккумулирующих ПОА, продолжающееся выявление новых продуцентов, открывшиеся грандиозные перспективы в связи с возможностями генетического манипулирования, а также приращение новых знаний о процессе биосинтеза и свойствах ПОА в целом обещают расширение возможностей и перспектив для данных биопластиков, как материала XXI века.
2.6. Субстраты и способы биосинтеза полиоксиалканоатов
Несмотря на большое количество известных типов ПОА, как было отмечено выше, в настоящее время только несколько из них всесторонне изучаются и производятся или планируются к производству в промышленных масштабах. Это полимеры и сополимеры 3- и 4-оксимасляной кислоты (3ПОБ,4ПОБ,3ПОБ-со-4ПОБ), сополимеры оксимасляной и оксивалериановой кислот (3ПОБ-со-3ПОВ), сополимеры оксигексановой и оксиоктановой кислот (3ПОГ-со-3ПОО)
(Braunegg et al., 1998; Lee, 1996; Madison, Huisman, 1999) и недавно охарактеризованные сополимеры оксибутирата и оксигексаноата
(Kobayashi et al., 1994).
Из более чем 300 известных представителей микроорганизмов, синтезирующих полиоксиалканоаты, в качестве реальных кандидатов для промышленного использования активно изучаются и рассматриваются небольшое число продуцентов. Это Alcaligenes eutrophus, Alcaligenes latus Azotobacter vinelandii, Pseudomonas oleovorans, несколько штаммов метилотрофов и трансгенные штам-
мы E. coli, Al. eutrophus, Klebsiella aerogenes. Данные организмы об-
ладают свойствами, необходимыми для промышленного продуцента биопластиков. Среди таковых – способность синтезировать ПОА в плотных культурах и с высокими выходами при относительно небольших затратах времени, высокая валовая продуктивность на единицу объема биореактора, способность усваивать различные источники углерода с высокой степенью конверсии субстрата в продукт, отсутствие серьезных трудностей в ходе процедуры экстракции и очистки полимеров, необходимые физико-химические свойства
92
синтезируемого полимера (молекулярная масса, кристалличность, температура плавления, механическая прочность и др.).
В значительной мере стоимость ПОА определяется затратами на исходное сырье, поэтому одно из магистральных направлений исследований ориентировано в настоящее время на поиск доступных субстратов для их получения. С этой целью в настоящее время активно изучают закономерности и эффективность биосинтеза ПОА уже известными организмами с привлечением новых субстратов, продолжают поиск новых природных штаммов-продуцентов ПОА и конструируют трансгенные продуценты, способные усваивать различные, в т. ч. новые субстраты. Для получения полиоксиалканоатов в принципе возможно привлечение разнообразных субстратов. Среди известных
– индивидуальные соединения (углекислый газ и водород, сахара, спирты, органические кислоты), отходы спиртовой, сахарной, гидролизной промышленности, производства оливкового и пальмового масла и др., а также необычные субстраты, включая токсичные.
Бактерии, используемые для получения ПОА, по применяемым методам культивирования подразделяют на две группы. К первой относятся организмы, эффективный синтез ПОА у которых происходит при избытке источника энергии и углерода в среде, но при лимитировании роста одним из биогенных элементов (азотом, серой, фосфором, калием, магнием или кислородом). К этой группе отно-
сятся Alcaligenes eutrophus, Azotobacter vinelandii, Pseudomonas oleovorans и другие.
Ко второй группе относятся микроорганизмы, характеризующиеся способностью эффективно синтезировать ПОА при высоких скоростях роста, без ограничения роста каким либо лимитирующим фактором. Это Alcaligenes latus и рекомбинантные организмы, содержащие биосинтетический оперон из Al. eutrophus.
Исходя из физиолого-биохимических особенностей микроорга- низмов-продуцентов ПОА, на практике для получения полимеров используют в основном два типа культивирования, – периодическое (или периодическое с подпиткой субстратом) и проточное. Однако, и при периодическом, и при проточном способах ферментации необходимо создать условия, при которых обеспечивается высокая продуктивность процесса.
У микроорганизмов, относящихся к первой группе, аккумуляция ПОА наиболее активно происходит при несбалансированном росте в медленно растущих клетках, следовательно, высокопродуктивные проточные системы ферментации для таких продуцентов не приемлемы. В этой связи возникает вопрос, как получить большие урожаи биомассы одновременно с высоким (до 70 % и выше) внутриклеточным содержанием ПОА. Поэтому микроорганизмы первой группы, как правило, выращивают в периодическом режиме, применяя либо
93
двухстадийный процесс, либо два последовательно работающих аппарата. На первой стадии (или в первом аппарате), в ходе которой микроорганизмы выращивают на полной питательной среде, происходит образование практически всей биомассы. Далее, на втором этапе используют среду, из состава которой исключают один из биогенных элементов, и процесс продолжают еще некоторое время (15– 30 часов). За это время прироста биомассы практически не происходит, а наблюдаемое увеличение плотности культуры связано главным образом с увеличением массы полимера в клетках. Для максимального выхода полиоксибутирата и сополимеров ПОБ-со-ПОВ (до 80 % к весу сухого вещества) в таком режиме культивирования, например, у Alcaligenes eutrophus, используют на первом этапе полную питательную среду, а на втором – не содержащую азота. (Byron, 1987; Kim et al., 1994a,b). Однако соотношение длительности этих двух фаз и оптимальную величину биомассы, накапливаемую на первом этапе, следует строго определять исходя из конечной цели процесса, предварительно исследовав кинетику образования биомассы и выхода ПОА при заданных условиях культивирования. Так, в экспериментах с Alcaligenes eutrophus продемонстрировано (Kim et al., 1994a), что при двустадийном процессе концентрация ПОБ в культуре может быть увеличена с 71 до 92 г/л, соответственно, при изменении урожая клеток от 30 до 55 г/л; а при увеличении клеточной концентрации до 70 г/л конечная концентрация полимера достигает 121 г/л. Однако при полном исчерпании азота из среды урожай клеток снижается до 90 г/л, при этом происходит также снижение внутриклеточной концентрации полимера и его валовой продукции. У других представителей данной группы более эффективная продукция полимеров происходит при культивировании бактерий в условиях действия лимитирующего фактора, а не при полном исчерпании из среды какого-либо биогенного элемента.
Для бактерий второй группы также используют периодический тип культивирования, однако при этом питательная среда содержит все необходимые элементы, концентрацию которых корректируют по мере увеличения клеток в культуре, а также вводят в состав среды дополнительные органические источники азота (кукурузный и соевый экстракты, рыбный пептон). Это обеспечивает хорошие выходы клеточной биомассы при высоком внутриклеточном накоплении ПОА, так как эти два процесса у микроорганизмов конститутивно сбалан-
сированы (Page, Cornish, 1993; Lee, Chang 1994 а). Снижение кон-
центрации биомассы, например, в культуре у Alcaligenes latus, приводит, как правило, и к снижению уровня ПОБ. Рекомбинантные штаммы, полученные на основе быстрорастущей E. coli с клонированными из Al. eutrophus генами синтеза ПОБ, обеспечивают очень
94