Отмечена выраженная нестабильность включений оксивалерата
иоксигексаноата в ПОА. Это проявлялось в непостоянстве химического состава гетерополимеров в ходе их аккумуляции клетками при росте на смешанном углеродном субстрате. Включения оксивалерата и оксигексаноата выявляли в ПОА уже через 1.0–1.5 часа после внесения добавки кислоты в культуру; далее в течение некоторого времени (обычно 4–6 часов) при последующей ферментации доля этих компонентов в гетерополимере обычно возрастала на фоне общего накопления ПОА в клетках и снижения доли оксибутирата. Однако при продолжении ферментации в последующие часы содержание оксивалерата и оксигексаноата в ПОА снижалось на фоне возрастания доли оксибутирата и продолжающегося увеличения суммарного содержания полимера в клетках. Обычно спустя 10–15 часов после внесения добавки-индуктора в среду данные включения в полимере не обнаруживали, несмотря на увеличение общего содержания гетерополимера в клетках. Аналогичная картина обнаружена нами ранее при образовании водородными бактериями и карбоксидобактериями сополимеров оксибутирата и оксивалерата. Таким образом, время максимального накопления полимера в клетках в целом не совпадает у водородных бактерий и карбоксидобактерий с максимумом включения в ПОА сополимеров оксивалерата и оксигексаноата. Это существенное обстоятельство следует учитывать при исследовании процесса образования гетерополимерных полиоксиалканоатов.
Всерии экспериментов при варьировании количества добавок кислот (одна, две, три) и последующего после добавки времени ферментации (от 4–6 до 20–30 часов) реализованы режимы ферментации, позволяющие получать сополимеры с различным соотношением оксибутирата, оксивалерата и оксигексаноата. Это позволяет стабильно получать трехкомпонентные образцы полиоксиалканоатов, однако включения оксигексаноата не превышают 2–3 мол. % у штамма В 5786. У штамма Z 1062 включения оксигексаноата на порядок выше, однако вследствие более низких общих выходов полимера использование его в качестве продуцента представляется проблематичным (Волова с соавт., 1998).
Мутантные штаммы R. eutropha, утилизирующие в качестве источника углерода глюкозу, способны обеспечивать высокие урожаи при содержании полимера до 80 % и выше, в т. ч. в условиях двухступенчатой культуры, когда на первом этапе с целью накопления биомассы организм выращивают в проточном режиме при избытке азота
илимите глюкозы; на втором – при лимите азота с постепенным снижением его концентрации. Продуктивность культуры по полимеру составляет 1.23 г/л ч.; содержание ПОБ – 72.1 % (Du et al., 2001).
80
Альтернативой параметрически управляемому подходу может стать использование для синтеза сополимеров ауксотрофных мутантных штаммов – продуцентов аминокислот (Madison, Huisman, 1999). Как известно, пропионил-КоА является интермедиатом деградационного пути треонина, валина и изолейцина. Мутантные штаммы с дефектами данного пути идентифицированы недавно как продуценты сополимеров (3-ПОБ-со-3-ПОВ). Так, штамм R. еutropha является прототрофным ревертантом изолейцинового ауксотрофного штамма R. eutropha H16 и способен аккумулировать 3-ПОБ-со-3-ПОВ с 7 % включением валерата на средах с фруктозой, глюконатом, сукцинатом, ацетатом и лактатом. Компенсируя дефектную треониндегидротазу, штамм суперпродуцирует ацетолактатсинтазу и секретирует валин, а также лейцин и изолейцин. При лимите азота, однако, происходит сверхсинтез промежуточных продуктов синтеза процессоров данных аминокислот – 2-кето-3-изовалерата и 2-кето-3- метилвалерата, и последующая деградация их до пропионил-КоА интермедиатов. Добавление треонина, изолейцина и валина в культуру R. eutropha SH-69 обеспечивает включение валерата в полимер, соответственно, до 53, 41 и 15 %. Валин и изолейцин, в отличие от треонина, не токсичны для культуры, их концентрация может составлять до 50 мМ. Когда концентрация аминокислот достигает 10 мМ, фракция оксивалерата в полимере достигает концентрации аминокислот. Штамм R. eutropha NCIMB 11599, напротив, не включает валерат при добавках треонина и включает только до 2% от изолейцина или валина (Yoon et al., 1995). При ресуспендировании штамма R. eutropha H16 в среде с треонином в качестве источника углерода при лимите ионов натрия или кислорода синтезируется около 6 % ПОА с 5 % включением валерата (Nakamura et al., 1992).
Эти эксперименты говорят о больших перспективах использования метаболической инженерии для получения суперпродуцентов различных по составу и структуре ПОА. Например, использование хорошо изученных и применяемых в промышленных масштабах ауксотрофных мутантных штаммов E. coli – суперпродуцентов аминокислот (Debabov et al., 1998), при комбинировании в них метаболических путей синтеза аминокислот с путями синтеза ПОА обещает колоссальные перспективы для успешного и экономически приемлемого производства сополимеров.
Alcaligenes latus также считается перспективным продуцентом полиоксиалканоатов, но в отличие от R. eutrophus этот организм характеризуется способностью синтезировать полиоксиалканоаты при продуктивном росте без каких-либо ограничений компонентами среды (Hangii, 1990; Hrabak, 1992). В связи с тем, что аккумуляция полиоксиалканоатов у данного микроорганизма осуществляется при высоких значениях скорости роста, его выращивание проводят в одну
81
стадию или в проточном режиме при наиболее высоких из известных в настоящее время значениях продукции (за 18 часов ферментации урожай и концентрация полимера в культуре достигают, соответственно, 142 и 68 г/л. Однако недостаточно высокие выходы ПОА (около 50 % к АСБ) ухудшают общие показатели (Yamane et al., 1996a, b). В качестве источника углерода организм утилизирует сахарозу, поэтому для его выращивания приемлемы сахаросодержащие отходы ряда производств меласса, тростниковый сахар и др.). Помимо ПОБ, организм синтезирует сополимеры (3-ПОБ-со-3ПОВ) на смешанном углеродном субстрате, содержащем сахарозу и добавки ва-
лерата или пропионата (Ramsey et al., 1990a; Chen et al., 1991),
включение оксивалерата в полимере достигает 45 мол.%; в полимере присутствуют также сополимеры 3- и 4-оксибутирата в одностадийном процессе при добавлении в среду с сахарозой - бутуролактона (Hiramitsu et al., 1993). Последний превращается в 4- ПОБ с высоким уровнем конверсии (до 60 %), что существенно выше по сравнению с Ralstonia.
Полиоксиалканоаты необычного состава и с новыми свойствами были обнаружены в бактериях рода Pseudomonas. Профессор Витольт в ходе приготовления замораживанием образцов для электронной микроскопии, обнаружил, что включения Ps. oleovorans при росте на 50 % октане имеют другую конфигурацию по сравнению с ПОБ (De Smet et al., 1983). Химический анализ показал, что включения состоят на 89 % из 3-оксиоктаноата, остальные 11 % являются 3-
оксигексаноатом (Lageveen et al., 1988).
Вскоре было установлено, что микроорганизмы, относящиеся к роду Pseudomonas, способны аккумулировать различные по составу полимеры, содержащие мономерные единицы с длиной углеродной цепи от С4 до С12 при росте на n-алканах, n-алканоатах, n-алкенах и n-спиртах (Huisman et al., 1989; Anderson, Dawes, 1990).
Установлено, что бактерии Pseudomonas putida способны синтезировать разнообразные по составу ПОА при росте на глюкозе. В гетерополимерных ПОА идентифицированы: 3-оксидеканоат (в качестве доминирующего мономера), а также 3–оксигексаноат и 3- оксиоктаноат и другие насыщенные и мононенасыщенные мономеры с длиной цепи С12 и С14 атомов углерода (Huijberts et al., 1992). Активный синтез средне- и длинноцепочечных ПОА в псевдомонадах происходит потому, что длинноцепочечные жирные кислоты, например, (С18:1), превращаются в реакциях -окислительного пути за два оборота цикла в С8 и С10 мономеры, которые по сравнению с октаноатом легко включаются в ПОА. Олеиновой кислоте, например, для включения в С10 требуется 4 молекулы ацетил-КоА. Эта конверсия эквивалентна 20 молям АТФ на восстановительном этапе, который реализуется в то время, когда выделяющаяся энергия не может дис-
82
сипировать. Напротив, включение декановой и октановой кислот в длинноцепочечные ПОА эквивалентно 2 молям АТФ. Поэтому урожай полимера на клетку выше при использовании длинноцепочечных жирных кислот.
Далее были обнаружены другие штаммы, способные синтезировать различные по составу средне- и длинноцепочечные полиоксиалканоаты. Был выделен штамм Pseudomonas sp. А33, синтезирующий сополимеры 3-гидроксибутирата и еще 9 разнообразных мономеров, включая насыщенный 16-ти углеродный оксигексадеканоат (0.2 мол %) и три ненасыщенных: 3-оксидодеценоат (21 мол. %), окситетрадеценоат (3.4 мол. %) и 3-оксигексадеценоат (1.4 мол. %) (Lee et al., 1995a). С использованием различной аналитической техники авторы доказали, что это не смеси, а, именно, сополимерные ПОА. Ненасыщенные длинноцепочечные полиоксиалканоаты, как оказалось, продуцирует Pseudomonas oleovorans при росте на n– октане и 1-октене (De Smet et al., 1983). Эти организмы при росте на смесях 5-фенилвалерата и n–нонановой или n–октановой кислотах продуцируют два различных по составу длинноцепочечных полимера: один – с соответствующей 3-оксиалканоатовой единицей, другой
– c 3-окси-5-фенилвалерат (до 40 мол. % к общей массе полимера). Общий выход ПОА при этом, однако, низок (Kim et al., 1991). При росте организма на цианоундекановой кислоте в составе ПОА идентифицировано до 32 мол.% циано-содержащих мономеров, подобных 9-циано-3-оксинонаноату и 7-циано-3-оксигептаноату (Lenz et al., 1992). P. oleovorans синтезирует также полимеры, содержащие в своем составе хлоро- и флюоринсодержащие включения (Abe et al., 1990; Kim et al., 1996); бромоктановые кислоты (Kim et al., 1998) и
ПОА, содержащие терминальные эпоксигруппы (Bear et al., 1997). Исследования закономерностей ферментации Pseudomonas с
целью продукции полиоксиалканоатов активно проводятся в настоящее время. Установлено, что P. pseudoflava растет с хорошими показателями в периодической культуре на глюкозе, ксилозе или арабинозе, синтезируя поли-3-гидроксибутират, а также в хемостате на гидролизатах гемицеллюлоз (Bertrand et al., 1990). P. pseudoflava и P. oleovorans синтезируют длинноцепочечные ПОА (Ramsay et al., 1991) при росте в хемостатной культуре на октаноате натрия в качестве источника углерода. Показано, что изменением источника углерода и соотношения С/N в среде можно управлять мономерным составом полиоксиалканоатов, синтезируемых P. putida KT2442, получая четырех- и шестикомпонентные гетерополимеры при различных уров-
нях их продукции (Preusting et al., 1992; Huijberts and Egging, 1996).
Таким образом, различные микроорганизмы, Ralstonia eutrophus, А. latus; Pseudomonas oleovorans, Ps. putida, Azotabater vinelandii и Methylobacterium extorquens, достаточно полно охарак-
83
теризованные к настоящему времени, являются основой для разработки различных по эффективности способов получения разнообразных полиоксиалканоатов.
Вместе с тем, поиск и выделение новых микроорганизмов, синтезирующих полиоксиалканоаты, продолжается. Сточные воды и промстоки, содержащие в достаточно высоких концентрациях разнообразную углеродсодержащую органику, включая различные жирные кислоты, являются перспективным источником для выделения ПОАсинтезирующих организмов. Среди выделенных организмов, конвертирующих органическое вещество стоков в ПОА, представители раз-
личных таксонов: Sphaerotilus, Agrobacterium, Rhodobacter, Acinobacillus и др.
Так, изолят Sphaerolitus natans, являющийся типичным компонентом активного ила, способен накапливать до 30 % полиоксибутирата к весу сухого вещества клетки, а полученный на его основе мутантный штамм синтезирует до 50–67 % ПОБ (Takeda et al., 1995a,b) и характеризуется высокой (до 6 г/л) толерантностью к пропионату. Это в 6 раз выше по сравнению с R. eutropha. Штамм перспективен для синтеза 3-ПОБ-со-3-ПОВ на смесях глюкозы и пропионата. Два штамма Agrobacterium sp., SH-1 и GW-014, выделенные также из активного ила, охарактеризованы как продуценты ПОБ на среде с глюкозой. В зависимости от типа и концентрации углерода, на средах с различными гексозами (сахарозой, глюкозой, фруктозой), выход полимера составляет от 30 до 80 % при возможном включении валерата от 3 до 11 мол. %. На пентозных сахарах (арабинозе или ксилозе) концентрация полимера не выше 35 % при уровне включения валерата от 8 до 11 мол. %. Пропионил-КоА для образования мономеров 3-оксивалерата в данном случае синтезируется из сукцината по ме- тилмалонил-КоА-пути, при этом накопление валерата зависит от концентрации ионов Co2+, входящих в состав В12-зависимой метил- малонил-КоА мутазы. В оптимизированной периодической культуре на глюкозо-пропионатной среде выход полимера достигает 75 % при соотношении бутирата и валерата как 1:1 (Lee et al., 1995). Эффективное образование ПОА установлено для анаэробной Rhodobacter sphaeroides на средах с отходами производства пальмового масла. В Малайзии отходы данного производства, содержащие органические кислоты, конвертировали в метан, который сбрасывали затем в атмосферу. Комбинирование процессов – анаэробной трансформации отходов в органические кислоты, используемые затем в качестве углеродного субстрата для образования ПОА, может оказаться перспективным (Hassan et al., 1997). Выделенный из почвы штамм R. sphaeroides, как установлено, синтезирует ПОА в экспоненциальной фазе роста. Штамм, обладая высокой потребностью в кислороде, способен эффективно усваивать сахара и азотсодержащие компо-
84