ненты стоков. При уменьшении обеспеченности кислородом штамм эффективно синтезирует ПОА с одновременной очисткой стоков. В связи с тем, что полимер синтезируется в условиях, не требующих лимитирования роста бактерий азотом, процесс весьма эффективен. Урожай биомассы составляет до 4.8 г/л, содержание полимера –
47 % (Son et al., 1996).
2.5.2. Генетически модифицированные организмы – продуценты ПОА
В последние годы в результате достижений в области молеку- лярно-генетических исследований и детального исследования системы синтеза полиоксиалканоатов появились перспективы для получения рекомбинантных штаммов как более эффективных продуцентов биополимеров. На этом пути, ориентированном на получение высокопродуктивных биосинтетиков полиоксиалканоатов с использованием разнообразных источников углерода, возможны два направления. Первое предполагает интродукцию субстрат-утилизирующих генов в бактериальные штаммы, синтезирующие ПОА для расширения их трофического потенциала. Второе использует гены системы синтеза ПОА для интродукции их в быстрорастущие микроорганизмы, не синтезирующие полиоксиалканоаты, но характеризующиеся широким органотрофным потенциалом. К настоящему моменту гены синтеза ПОА клонированы из нескольких десятков бактерий, что позволило получить разнообразные в таксономическом отношении продуценты полимеров, а также организмы, обладающие способностью синтезировать совершенно новые типы ПОА (Steinbüchel,
Valentin, 1995; Braunegg et al., 1998; Madison, Huisman, 1999; Sudech et al., 2001; Steinbüchel, 2001).
Синтез ПОА рекомбинантными бактериями
К настоящему моменту проведены достаточно широкие исследования, выясняющие характер влияния увеличения копийности генов на процесс образования полиоксиалканоатов микроорганизмами, принадлежащими к различным таксонам. Результаты исследований показали различную эффективность увеличения копийности phb или pha-генов, контролирующих синтез полиоксиалканоатов, у разных микроорганизмов. Обнаружено, что в ряде случаев увеличение уровня ПОА не связано с высокой копийностью pha генов. Эти результаты показали, что система регуляции ПОА-метаболизма многоуровневая. Например, когда pha гены из P. oleovorans интродуцировали в него же или в P. putida, увеличения синтеза ПОА не происходило. Эффект дополнительных копий ПОА-полимеразы экспрессированных генов дал существенные изменения в составе полимера
(Huisman et al., 1991) и снижение его молекулярного веса (Huisman et
85
al., 1991). Продукция полиоксибутирата в ПОБ-синтезирующем мутантном организме Rhizobium meliloty также только реконструировала дикий тип в то время, как добавление P. denitrificans phaC гена приводило к удвоению плазмиды и выхода ПОА по сравнению с уровнем в родительском штамме (Ueda et al., 1996).
Повышение активности ферментов системы синтеза ПОА продемонстрировано при гомологичной амплификации, выполненной с бактериями рода Alcaligenes. Когда плазмиду, сконструированную на основе генов синтеза ПОА из Al.eutrophus, интродуцировали в этот же организм, активность ПОА-синтазы возрастала, и в результате скорость продукции полимера в культуре стала в 1.24 раза выше по сравнению с родительским штаммом. В массовой периодической культуре штамм также более эффективно синтезировал полимер
(Steinbüchel, Valentin, 1995; Park et al., 1995).
Гетерологичная экспрессия ПОА-биосинтетических генов Al. eutrophus продемонстрирована в различных микроорганизмах. Когда phbCAB оперон из R. eutropha был интродуцирован в различные виды бактерий Pseudomonas, исходно не синтезирующих короткоцепочечные ПОА, в частности, полиоксибутират, была получена экспрес-
сия генов у P. aeroginosa, P. putida, P. oleovorans и др., и у данных организмов зафиксирован синтез смесей коротко- и среднецепочечных полимеров (Preusting et al., 1993). Вместе с тем, штамм Pseudomonas stutzeri, исходно не синтезирующий полиоксибутират, не приобретал способности к его синтезу после интродукции в него генов R. eutropha (Steinbüchel, Schübert, 1989). Рекомбинантный штамм K. aeroginones с включенными генами из Al. eutrophus начинал синтезировать полиоксибутират на среде с мелассой. Увеличение синтеза ПОА наблюдали также в Mycoplana rubra, трансформированной pha генами из Al.eutrophus.
При интродукции ПОА-синтетических генов Thiocapsa pfenningii в Ps. putida, рекомбинантный штамм на среде с октаноатом накапливал полиоксиалканоаты, содержащие 3-оксибутират, 3-оксиоктаноат и 3- оксигексаноат (Madison, Huisman, 1999). Недавно установлено, что штамм Synechococcus sp., содержащий phb гены R. eutropha, способен синтезировать 3-ПОБ с молекулярной массой до 465 000 Da на среде с ацетатом при лимите азота (Takahashi et al., 1998).
Несмотря на эти, вполне обнадеживающие результаты по манипулированию с phb генами R. eutropha, продолжался поиск более перспективного объекта для создания рекомбинантных продуцентов полиоксиалканоатов. Бактерии рода Alcaligenes, хорошо себя зарекомендовавшие в качестве промышленного продуцента ПОА, способны с большими выходами синтезировать разнообразные по составу и свойствам полимеры, имеют, однако, некоторые ограничения. Синтез ПОА у них происходит при низких скоростях роста, что
86
затрудняет процесс ферментации. Кроме этого, эти микроорганизмы не достаточно полно охарактеризованы генетически, что ограничивает их использование для генно-инженерного манипулирования. Этих проблем не возникает при рассмотрении быстро растущих и наиболее полно охарактеризованных в генетическом плане бактерий E. coli. Сконструированные к настоящему времени рекомбинантные штаммы E. coli, содержащие стабильные и высококопийные плазмиды с генами синтеза полиоксиалканоатов из Al. eutrophus и других бактерий, характеризуются способностью синтезировать высокие концентрации полимеров различного состава при общей высокой продукционной способности (Peoples et al., 1989; Janes et al., 1990; Kim et al., 1992; Lee et al 1994a, b, c).
Первые результаты по клонированию pha генов Al. eutrophus в E. сoli дали положительные результаты – в трансгенной бактерии зафиксировали образование гранул полиоксибутирата (Schübert et al., 1988; Slater et al., 1988), и организованный процесс получения ПОБ дал хорошие результаты. В периодической рН-статируемой культуре в течение 42 часов был получен выход полимера до 90 г/л (Kim et al., 1992). Коллектив под руководством д-ра Ли за короткий период получил около 10 различных штаммов с включенной parB стабильной phbCAB плазмидой (Lee et al., 1994a). Один из штаммов E. coli B синтезировал на среде с 2 % глюкозы до 76 % ПОБ; другие (E. coli W, K- 12, EC3132) образовывали от 15 до 33% полимера (к весу сухого вещества). Полученные несколько позже штаммы с высококопийной плазмидой, такие, как XL1-Blue, JM109, HB101, накапливали очень много полимера, до 75–85 % при скорости его синтеза до 2.1 г/л час (Lee et al., 1994b). В среду, при этом, добавляли комплексные источники азота (дрожжевой экстракт, триптон, смесь аминокислот). В рекомбинантном штамме XL1-Blue синтез полимера лимитирован НАДН, поэтому добавление аминокислот, а также олеата, обеспечивает синтез ПОБ восстановительными эквивалентами, необходимыми для высокого выхода ПОБ (Lee et al., 1995b). Суперэкспрессия FtsZ приводила к существенному повышению продуктивности; рекомбинантный штамм синтезировал до 70 % ПОБ при концентрации клеток в культуре, равной 104 г/л и продукции 2 г/л в час, что, однако, несколько ниже по сравнению с R. eutropha (Wang, Lee., 1998).
Одной из ключевых проблем продукции полиоксиалканоатов на основе трансгенных микроорганизмов является стабильность и постоянство экспрессии phb генов в новом хозяине. Получение ПОА на основе рекомбинантных организмов часто сопровождается снижением числа плазмиднесущих особей в популяции, а также понижением копийности плазмид в ходе репликации. Это может быть также следствием гибели части клеток, несущих гены устойчивости к антибиотикам, например, parB. Нестабильность phb генов в высокоплотных
87
культурах в ходе ферментации, сопровождающаяся падением продукции ПОА, влияет на его стоимость.
Большинство генноинженерных штаммов, применяемых для получения ПОА, растет на глюкозе, цена которой достаточно высока. Расширение трофического потенциала и вытекающая из этого возможность расширения и удешевления сырьевой базы для производства ПОА, чрезвычайно значимы. Однако результаты, полученные в этом направлении, пока не так значительны, как ожидалось. Так, интродукция -галоктозидазного гена и gal оперона E. coli в Al. eutrophus не позволила получить быстрорастущего на лактозе штамма (Pries et al., 1990). В другой работе, полученный рекомбинантный штамм Al. eutrophus с встроенными генами из Bacillus subtilis, сконструированный с целью продукции ПОА на сахарозе, также характеризовался очень медленным ростом. Сравнительно недавно полученный рекомбинантный штамм на основе E. coli и K. aerogenes, исходно утилизирующих сахарозу, способен, как оказалось, синтезировать от 45 до 70 % ПОБ при росте на среде с сахарозой (цена которой на 33–50 % ниже стоимости глюкозы) (Zhang et al.,1994). Штамм способен также включать в полимер до 55 % валерата в присутствии в среде пропионата, однако, он также не был достаточно стабильным.
Как было установлено сравнительно недавно, даже незначительное изменение соотношения мономеров в полиоксиалканоатах способно кардинально влиять на их свойства. Поэтому работы по метаболической инженерии ПОА-продуцирующих микроорганизмов, безусловно, не могли обойти этой возможности. В связи с тем, что включение валерата в ПОА, как правило, происходит при индуцирующих добавках в среду пропионата или валериановой кислоты, эта же стратегия была использована в работе с рекомбинантной кишечной палочкой. E. coli, как известно, охотно утилизирует пропионовую кислоту, поэтому культуру, растущую на ацетате или смесях глюкозы и пропионата, постепенно адаптировали к этому субстрату небольшими его добавками (Slater et al., 1992). В результате экспрессии конститутивных ato оперона и fad регулона в клетках E. coli происходила полная экспрессия ферментов, катализирующих реакции утилизации жирных кислот. При этом ato система обеспечивает транспорт ацетоацетата в клетке, и это приводит к начальной его активации и образованию ацетоацетил-КоА; atoAD cпособна также транспортировать в клетки пропионат; fad регулон кодирует ферменты для деградации жирных кислот, включая специфическую тиолазу (Clark, Cronan, 1996). Последняя, в свою очередь, способствует образованию 3-ПОБ в PhbA. Фракция валерата в полимере зависит от процентного содержания пропионата в ферментационной среде, однако, не превышает 40 мол. %. В связи с тем, что E. coli намного толерантнее к пропиона-
88
ту по сравнению с Al. eutrophus, ферментация такого штамма для получения 3-ПОБ-со-3-ПОВ может оказаться более эффективной. Известны трансгенные штаммы кишечной палочки (XL1-Blue, JM109, HB101), дающие высокие урожаи в плотной культуре при росте на глюкозе и пропионате и включающие до 7 мол. % валерата в ПОА (Yim et al., 1996). При этом установлено, что олеат стимулирует включение оксивалерата. Аналогично E. coli, получен рекомбинантный штамм Klebsiella, синтезирующий сополимеры оксибутирата с оксивалератом на среде с глюкозой и пропионатом (Zhang et al., 1994). С целью получения сополимеров 4-полиоксибутирата, hbcT гены Clostridium kluyveri, кодирующие 4-гидроксибутират-КоА трансферазу, интродуцированы в составе phbC плазмиды Al. eutrophus в E. coli. Полученный штамм синтезировал 4-полиоксибутират в присутствии 4- бутирата в среде (Hein et al.,1997), однако, пути в E. coli, приводящие к превращению 4-ПОБ в 3-ПОБ, пока не изучены. Трансгенный продуцент сополимеров 3-ПОБ-со-4-ПОБ получен также на основе кишечной палочки при интродукции в нее сукцинат-деградирующего пути из C. kluyveri в составе плазмиды, содержащей phb гены Al. eutrophus (Valentin, Danis, 1997). На среде с 1.5 % 4-гидроксибутирата штамм синтезировал до 46 % сополимера 4-ПОБ-со-3-ПОБ. Экспрессия phaCI гена Ps. oleovorans получена в рекомбинантном штамме E. coli, при этом зарегистрирован 12 % выход ПОА, содержащий включения 3-гидроксигексаноата и 3-гидроксиоктаноата в присутствии в среде жирных кислот (от С8 до С18) (Ren et al., 1996).
В целом полученные результаты в области метаболической инженерии синтеза ПОА обнадеживают и позволяют надеяться на возможность конструирования новых эффективных штаммов для получения биополимеров, обладающих: 1) способностью к быстрому росту в высокоплотных культурах с высокой общей продуктивностью, 2) синтезирующих большие количества полимеров с использованием различных углеродных субстратов, а также 3) облегчающих процедуру экстракции полимера из клеточной биомассы и 4) позволяющих контролировать внутриклеточную деполимеразную систему, деградирующую синтезированный полимер.
Метаболическая инженерия ПОА синтетических путей
ввысших организмах
Сцелью снижения продукционной цены и наращивания объемов промышленного производства ПОА в настоящее время рассматриваются проекты возможностей производства на основе высокоурожайных масличных сельскохозяйственных культур, таких как Brassica, кукуруза, подсолнечник, накапливающих большие количества жиров. Например, при выходе ПОА в растениях около 30 % можно было бы получить до 350 биллионов полимера. Потенциально
89