Материал: Polioxialkanoaty_POA__biorazrushaemye_polimery_dlya_meditsiny

ПОВ у A. eutrophus на разных углеродных субстратах (Doi et al., 1990). Клетки, содержащие 55 % ПОБ от абсолютно сухого вещества клетки, выращивали на пентановой кислоте в условиях азотного лимита. В течение 96 часов гомополимер был заменен сополимером, содержащим 44 мол. % бутирата и 56 мол. % валерата. После пересева клеток в среду, содержащую бутират, уровень оксивалерата в полимере упал с 56 % до 19 %. Эти результаты авторы объясняют тем, что в клетках одновременно идет синтез и деградация полимера. Это позволяет перестраивать состав полимера в зависимости от подаваемого углеродного субстрата. Циклический процесс ПОА метаболизма можно проиллюстрировать схемой (рис. 2.5) из работы (Doi et al., 1990). Аналогичная модель цикличности внутриклеточного процесса синтеза и деградации ПОБ предложена для Azospirillum brasilense (Tal et al., 1990).

Однако изучение обмена ПОБ у водородных бактерий, выращиваемых в условиях непрерывной культуры на среде с высоким соотношением С/N и с добавлением меченой глюкозы, показали, что радиоактивность в биомассе и в полимере падает с одинаковой скоростью. Авторы считают, что в течении роста не происходит существенного обмена ПОБ, а активность деполимеразы или очень низкая, или не проявляется совсем (Haywood et al., 1989).

2.5. Продуценты полиоксиалканоатов

Список микроорганизмов, способных с теми или иными выходами внутриклеточно аккумулировать полиоксибутират или продукты сополимеризации ПОБ с другими оксипроизводными жирных кислот, быстро пополняется. К настоящему времени он насчитывает свыше

300 организмов (Anderson, Dawes, 1990; Steinbüchel, Valentin, 1995; Braunegg et al., 1998; Madison, Huisman, 1999). Среди описанных ор-

ганизмов – аэробные и анаэробные бактерии, гетеротрофы, хемооргано- и хемотрофы, фототрофные прокариоты. (Azotobater, Alcaligenes, метанотрофы Bacillus, Nocardia, Methylobacter, Pseudomonas, Rhizobium, Zoogloea); аэробные фотобактерии (Chloroglaea, Chloroflexus); олиготрофные полипростековые бактерии (Labrys, Prosthecomicrobium, Stelle), архебактерии (Haloferax), анаэробные фототроф-

ные бактерии (Chromatium, Rhodosperillum) и другие.

Несмотря на имеющееся разнообразие изученных микроорганизмов, аккумулирующих ПОА, для промышленного использования рассматривается очень небольшое число продуцентов. Среди них – хемоорганотрофный организм Ralstonia (до недавнего времени известный как Alcaligenes), способный использовать различные источники углерода и гетеротрофные микроорганизмы, относящиеся к трем таксонам – Methylotrophus, Methylobacterium и Pseudomonas

66

(Anderson, Dawes, 1990; Lee, 1996; Choi, Lee, 1997; 1999; Steinbüchel,

Valentin, 1995; Braunegg et al., 1998; Madison, Huisman, 1999).

В качестве критериев для выбора потенциального продуцента полиоксиалканоатов принято рассматривать следующие показатели: химический состав (по соотношению С-мономеров, в % к полимеру), выход полимера (в % по отношению к весу абсолютно сухого вещества клетки), затраты углеродного субстрата (ед. веса/ед. веса ПОА), концентрацию биомассы клеток в культуре (вес/ед.объема), продуктивность процесса (ед. веса ПОА/ед. объема культуры/ед. времени). Результаты продукции полиоксиалканоатов наиболее перспективными продуцентами представлены в таблице 2.3.

Таблица 2.3 Образование полиоксиалканоатов различными микроорганизмами

(Lee et al., 1996b)

67

2.5.1. Природные штаммы – продуценты ПОА

Первыми в 70-х гг. существенный коммерческий интерес вызвали метилотрофные микроорганизмы в связи с доступностью и относительно низкой ценой метанола.

Принципиальная возможность использования метанола в качестве углеродного субстрата для получения полиоксиалканоатов была продемонстрирована на примере различных микроорганизмов:

Protomonas, Methylobacterium, мутантных штаммов Ralstonia eutropha, а также Pseudomonas denitrificans. Так, Methylobacterium extorquens, выделенный из почвы, синтезирует гомогенный полиоксибутират и его сополимеры с валератом (Bourque et al., 1992), соответственно, на метаноле и смесях метанола с валератом. В режиме с подпиткой субстратом на комплексном азотном источнике (с добавками рыбного экстракта), при контролируемой ЭВМ подаче метанола в культуру, скорость образования ПОА достигает 1.7 г/л ч; включение валерата в полимер может составлять до 20 мол. %. Другой изолят, M. extorquens sp. KCTC0048, помимо сополимеров 3-ПОБ-со-3-ПОВ, способен аккумулировать сополимеры 3-ПОБ-со-4-ПОБ при различном соотношении фракций 3-ПОВ и 4-ПОБ (Kang et al., 1993). К продукции ПОБ на метаноле при лимитировании роста азотом, а также магнием или фосфатом, способен факультативный метилотроф

Pseudomonas 135 (Daniel et al., 1992); мутантный штамм R. eutropha,

аккумулирующий ПОБ и ПОБ-со-ПОВ в периодической культуре при лимите азота (Alderete et al., 1993; Park, Damodaran, 1994), в т. ч. на средах с этанолом и пропанолом.

Детальное изучение метилотрофных организмов показало, что они не отвечают всем необходимым критериям, так как выходы полимера у метилотрофов недостаточно высокие (50–60 % к АСБ), а синтезируемый полимер характеризуется низкой молекулярной массой (40 000–60 000 Da). Затраты субстрата на образование полимера высоки (экономический коэффициент образования ПОА на мета-

ноле, Y, г/г, 0.18–0.20).

Azotobacter был следующим микроорганизмом, рассматриваемым в качестве потенциального продуцента ПОА. Интересен в этом плане организм Azotobacter vinelandii UW, синтезирующий полиоксибутират на доступных углеродных субстратах (Page, Knops, 1989). Обнаружив очень низкий уровень НАДН оксидазной активности в выделенном организме, авторы связали эту особенность со способностью организма эффективно синтезировать полиоксибутират с высоким выходом (до 65–75 % к сухому веществу клетки) во время экспоненциального роста, посчитав, что процесс синтеза ПОБ есть один из путей, в котором возможно восстановление НАД. Далее было показано, что синтез ПОБ связан с азотфиксацией (Page, 1992; Page, Cornish, 1993). Авторы показали, что при азотфиксации в штамме

68

UWD во время истощения азота в ассимиляционных условиях этот процесс зависит от полиоксибутирата, так как последний обеспечивает энергией реакцию нитрогеназы. Добавки в среду рыбного пептона в качестве комплексного источника азота стимулируют высокую скорость синтеза ПОБ на фоне высокого урожая биомассы. Штамм также способен утилизировать мелассу, а при индуцирующих добавках пропионата накапливает сополимеры 3-ПОБ-со-3-ПОВ. Максимум продукции полимера при этом составляет до 1 г/л в час. При росте на среде с валератом в качестве единственного источника углерода уровень 3-ПОВ в полимере достигает 45 мол. %. Однако процесс синтеза полиоксиалканоатов в азотобактере не стабилен и сопровождается накоплением в клетках полисахаридов, что затрудняет процедуру экстракции полимера и отражается на его свойствах. Ряд штаммов Azotobacter beijerinckii рассматривают в качестве потенциальных продуцентов ПОА на средах с мелассой, продуктах гидролиза кукурузы и т. п. Возможности оптимизации процесса позволяют надеяться на достаточно продуктивный процесс синтеза полимера при оптимальной концентрации мелассы, равной 65.4 г/л

(Purushothaman et al., 2001).

Третьими организмами, вызвавшими интерес, в частности ICI, были хемоорганотрофные водородные бактерии Ralstonia (Alcaligenes), которые синтезировали высокомолекулярный полимер с высокими выходами (до 80 % и выше), используя в качестве источника углерода при автотрофном росте диоксид углерода (в смеси с водородом), а при гетеротрофном – фруктозу. В результате был реализован первый крупномасштабный процесс получения полиоксибутирата на фруктозе при стерильной ферментации в аппарате объемом 200 000 л (Byron, 1987).

Бактерии, относящиеся к таксону Ralstonia eutrophа, синтезируют полиоксиалканоаты с высокими выходами на минимальной солевой среде при нормальном рН и 30 С, используя в качестве источника углерода углекислоту, а также разнообразную органику, однако из сахаров – только фруктозу. Усиление скорости синтеза ПОА начинается в конце линейной фазы роста бактерий в условиях периодической культуры по мере снижения скорости синтеза белка и достигает максимума на стационарной фазе. Происходит это у R. eutrophus при так называемом несбалансированном росте, лимитированном одним из элементов минерального питания (азотом, фосфором, серой и др.). Выходы ПОА, длительность ферментационного цикла на различных субстратах при различных режимах выращивания и продуктивность процесса варьируют в широких пределах, соответственно,

70–87 %, 60–120 час, 0.3–2.42 г/л/час (Byron, 1992; 1994).

В литературе описано много штаммов данного микробного вида. Наиболее изученными и используемыми в качестве продуцента

69