Материал: Metod_Dipl_bak_2017_РВЦ (3)

У підрозділі 3.2 (Розрахунок потужності виробництва) наводяться дані про випуск продукції в Україні (перелік підприємств), а також дані щодо імпорту. З врахуванням розрахованої річної потреби у цільовому продукті і даних щодо його випуску та імпорту, обґрунтовується необхідна потужність виробництва.

Виконання підрозділів 3.3 (Розрахунок об’єму ферментера та кількості виробничих циклів) та 3.4 (Розрахунок кількості стадій підготовки посівного матеріалу) здійснюється як у курсовій роботі (дисципліна «Технології мікробного синтезу лікарських засобів» [5], 3-й курс) та курсовому проекті (дисципліна «Основи проектування біотехнологічних виробництв» [2], 4-й курс).

При розрахунку кількості виробничих циклів обов’язково наводиться тривалість кожної операції циклу роботи ферментера.

Приклад 11. Наведення опису циклу роботи ферментера.

Підготовка ферментера включає: миття та огляд (2 год), перевірка на герметичність (2 год), стерилізація (2 год), охолодження (до 2 год), завантаження середовища (1 год), засів (0,5 год), вивантаження культуральної рідини (1 год).

Зверніть увагу! Залежно від об’єму ферментатора тривалість підготовчих робіт буде різною.

Розділ 4. Біосинтез цільового продукту Зверніть увагу! Вимоги до виконання цього розділу наведено у

методичних рекомендаціях до виконання курсової роботи з дисципліни «Біохімічні основи мікробного синтезу» [6].

Підрозділ 4.1. Шляхи катаболізму ростового субстрату у біологічного агента.

У цьому підрозділі студент на основі даних підрозділу 2.1, що стосуються складу обраного поживного середовища, використовуючи електронну базу

KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) повинен навести і описати схему катаболізму ростового субстрату у біологічного агента із зазначенням ключових ферментів з їх класифікаційними номерами у дужках. За відсутності певного штаму або виду в базі KEGG описують метаболізм близькоспорідненого мікроорганізму (наприклад, представника того самого роду).

Приклад 12. Шляхи катаболізму глюкози у Corynebacteruim. glutamicum

АТСС13032

Джерелом вуглецю та енергії (ростовим субстратом) у поживному середовищі (для біосинтезу метіоніну є глюкоза [12].

Згідно Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes [14] катаболізм глюкози у C. glutamicum АТСС13032 відбувається за шляхом Ембдена–Мейєргофа–Парнаса (гліколіз), про що свідчить наявність відповідного ключового ферменту 6-фосфофруктокінази 1 (КФ.2.7.1.11).

Гліколізу у C. glutamicum АТСС13032 притаманні певні особливості, пов’язані з ферментами, що функціонують у даному метаболічному шляху. Так, перетворення α-D-

21

глюкозо-1-фосфату на α-D-Глюкозо-6-фосфат відбувається під дією ферменту фосфоглюкомутази (КФ.5.4.2.2). Фермент глюкозо-6-фосфатізомераза (КФ.5.3.1.9) каталізує взаємне перетворення α-D-глюкозо-6-фосфату, β-D-Фруктозо-6-фосфату і β-D- глюкозо-6-фосфату. З β-D-Фруктозо-6-фосфату під дією 6-фосфофруктокінази 1 (КФ.2.7.1.11) утворюється β-D-фруктозо-1,6-дифосфат, частина якого за допомогою фруктозо-1,6-біфосфатази ІІ (КФ.3.1.3.11) зворотно перетворюється на попередню сполуку.

Фермент фруктозобіфосфатальдолаза, клас ІІ (КФ.4.1.2.13) здійснює перетворення β- D-фруктозо-1,6-дифосфату на дві сполуки: гліцеральдегід-3-фосфат та дигідроксиацетонфосфат. Ізомеризація 3-фосфогліцерату відбувається під дією двох ферментів: 2,3-біфосфатзалежної фосфогліцератмутази (КФ 5.4.2.11) та фосфогліцератмутази (КФ 5.4.2.12). Заключною реакцією гліколізу є перетворення фосфоенолпірувату на піруват, що каталізується ферментом піруваткіназою. Далі піруват залучається до метаболізму за участю специфічної піруватдегідрогенази Е1 (КФ 1.2.4.1) або дигідроліпоаміддегідрогенази (КФ 1.8.1.4).

Схему катаболізму глюкози за шляхом Ембдена – Мейєргофа – Парнаса наведено на рис. 4.1.

Підрозділ 4.2. Біотрансформація ростового субстрату у цільовий продукт.

У цьому підрозділі на одному аркуші (формат А3 і більше) студент повинен навести, а в пояснювальній записці описати схему біосинтезу цільового продукту, починаючи з реакцій метаболізму ростового субстрату (джерела вуглецю і енергії у середовищі культивування). В описі схеми необхідно обов’язково вказувати, які ферменти здійснюють ті чи інші перетворення із зазначенням їх класифікаційних номерів. У процесі складання схеми біосинтезу необхідно враховувати конкретні шляхи катаболізму певного субстрату, які функціонують у клітинах даного біологічного агента.

Приклад 13. Біосинтез метіоніну C. glutamicum АТСС13032 з глюкози

Під час росту C. glutamicum АТСС13032 на середовищі 2 глюкоза (джерело вуглецю) перетворюється на піруват у гліколізі [14]. Далі піруват під дією дигідроксиліпоаміддегідрогенази (КФ 1.8.1.4) перетворюється на ацетил-КоА, який залучається до циклу трикарбонових кислот (ЦТК).

Метіонін належить до аспартатної родини амінокислот, попередником якої є оксалоацетат (інтермедіат ЦТК). Оксалоацетат перетворюється на аспартат, який відновлюється через 4-аспартилфосфат (фермент аспартаткіназа, КФ 2.7.2.4) до напівальдегіду аспарагінової кислоти (фермент аспартатнапівальдегіддегідрогеназа, КФ 1.2.1.11) [14]. Напівальдегід аспарагінової кислоти через гомосерин перетворюється на О- ацетилгомосерин. Необхідно зазначити, що такий інтермедіат характерний саме для C. glutamicum, у той час як у більшості мікроорганізмів утворюється О-сукцинілгомосерин [9].

У продуцентів метіоніну є два шляхи включення сірки до структури амінокислоти: транс-сульфурування та пряме сульфідування. У багатьох мікроорганізмів функціонує лише один шлях, у той час як у C. glutamicum – обидва. Під час транс-сульфурування сірка з цистеїну залучається до метаболізму на рівні цистатіоніну, а за функціонування прямого сульфідування – у вигляді сульфіду при перетворенні О-ацетилгоморесину на гомоцистеїн [1, 5, 9]. Заключною реакцією, в результаті якої утворюється метіонін, є трансформація

22

гомоцистеїну під дією гомоцистеїнметилтрансфераз (КФ 2.1.1.13; КФ 2.1.1.14).

Пул оксалоацетату у C. glutamicum поповнюється карбоксилюванням фосфоенолпірувату та пірувату. Ці анаплеротичні реакції каталізують ферменти фосфоенолпіруваткарбоксилаза (КФ 4.1.1.31) та піруваткарбоксилаза (КФ 6.4.1.1) [14].

Схему перетворення ростового субстрату глюкози на кінцевий продукт метіонін наведено на рис. 4.2 [14].

Розділ 5. Обґрунтування вибору технологічної схеми

Уданому розділі викладення матеріалу має бути за принципом «не як , а чому» (не описувати способи реалізації певної стадії, а акцентувати увагу на причини вибору однієї з них).

Підрозділ 5.1.1. Обґрунтування способу культивування.

Уцьому підрозділі студент повинен обґрунтувати вибір способу культивування (глибинне, твердо-фазне, періодичне, безперервне, напівбезперервне) конкретного біологічного агента для забезпечення максимальної ефективності процесу біосинтезу. Підставою для вибору параметрів біосинтезу (рН, температура, аерація, перемішування тощо є інформація з розділу «Характеристика біологічного агента», а також відомості про фізико-хімічні властивості цільового продукту.

Так, наприклад, відомо, що у процесі безперервного культивування продуцентів мікробних екзополісахаридів можливе виникнення варіантів, які синтезують цільовий продукт із зміненими реологічними характеристиками, тому зазвичай одержання цих метаболітів здійснюють під час періодичного культивування продуцентів.

Якщо оптимум рН для продуцента цільового продукту перебуває у межах 4,0−4,5, або біологічний агент є термофілом (оптимальна температура 45−55°С), можлива реалізація процесу біосинтезу у нестерильних умовах.

На підставі інформації про відношення біологічного агенту до кисню та їх потреб у розчиненому кисні обґрунтовується вибір режимів перемішування та інтенсивності аерації для забезпечення необхідної інтенсивності масопереносу кисню під час проведення аеробного біосинтезу.

Так, наприклад, під час біосинтезу мікробних екзополісахаридів спостерігається підвищення в’язкості культуральної рідини, що супроводжується зниженням ефективності масообміну, тому для культивування продуцентів цих мікробних метаболітів доцільніше використовувати ферментер

зрегульованою кількістю обертів перемішуючого пристрою (наприклад, від 100 до 400 об/хв на початку і в кінці процесу культивування відповідно). Крім того, збільшення в’язкості культуральної рідини у процесі синтезу полісахаридів необхідно враховувати і під час вибору типу перемішуючого пристрою.

Приклад 14. Обґрунтування способу культивування Amycolatopsis mediterranei NCH − продуцента антибіотика рифампіцину.

Оскільки оптимальною температурою для культивування аеробного штаму A. mediterranei NCH є 30 °С, а оптимальним значенням рН нейтральне, то можливий ризик

23

контамінації сторонніми мезофільними і нейтрофільними мікроорганізмами. Це зумовлює необхідність забезпечення асептичних умов під час біосинтезу, чого неможливо досягти при поверхневому (твердо-фазному) культивуванні. Асептичні умови забезпечуються стерилізацією обладнання і комунікацій, поживного середовища, аераційного повітря, піногасників. Для запобігання контамінації в ферментері створюється надлишковий тиск.

У зв’язку з викладеним вище, культивування A. mediterranei NCH для біосинтезу рифампіцину здійснюють глибинним способом.

Незважаючи на суттєві переваги безперервного культивування перед періодичним, біосинтез рифампіцину здійснюється у періодичному процесі, оскільки максимальний синтез антибіотика відбувається у стаціонарній фазі росту продуцента. Отже, «підтримання» штаму-продуцента в експоненційній фазі росту є недоцільним, так як у цьому разі спостерігатиметься зниження концентрації антибіотику у культуральній рідині

Підрозділ 5.1.3. Вибір мийних та дезінфікуючих засобів

Вибір мийних та деззасобів часто ґрунтується або на вартості за 1 л концентрату, або 1 л робочого розчину. Це не завжди правильно, оскільки витрати робочого розчину різних мийних та деззасобів на обробку певної площі можуть бути різними. Очевидно, що об’єктивним критерієм вибору є вартість певного об’єму розчинів, необхідних для обробки однакової певної площі.

Дані щодо вибору мийних та дезінфікуючих засобів доцільніше наводити у вигляді узагальнюючої таблиці (приклад 15).

Підрозділ 5.1.4. Особливості підготовки та стерилізації поживного середовища

Повинні бути представлені дані розрахунку об’ємів середовищ, певних композицій і на основі цього здійснено вибір способу стерилізації (автоклав, безпосередньо інокуляторі чи ферментаторі, УБС тощо). На основі цього робиться висновок про необхідність наявності у технологічній і апаратурній схемі відповідних збірників, реакторів для приготування розчинів, композицій тощо:

−підготовка розчинів титрувальних агентів. Якщо у процесі культивування змінюється рН, або передбачається стерилізація розчину всіх солей (як фосфорних, так і солей кальцію, і магнію) безпосередньо у ферментаторі, то необхідною є наявність збірників для приготування розчинів кислоти та лугу;

−підготовка підживлювальних розчинів (якщо реалізується культивування з дробним внесенням субстрату) здійснюється в окремих реакторах;

−освітлення меляси потребує не тільки приготування розчину сірчаної кислоти, а й центрифуги для відділення осаду сульфату кальцію і збірника для фугату.

Зверніть увагу! Освітлення меляси передбачено у технології одержання хлібопекарських дріжджів, оскільки наявні у мелясі катіони кальцію інгібують ріст Saccharomyces cerevisiae. Термін «освітлення меляси» не треба плутати з поняттям «гідроліз меляси». Гідролізована меляса використовується для вирощування біологічних агентів, які не здатні асимілювати сахарозу. Стадія одержання гідролізованої меляси після добавлення до розбавленої удвічі

24