Материал: Metod_Dipl_bak_2017_РВЦ (3)

ВСТУП

Вітаміни – це низькомолекулярні органічні речовини, здатні у дуже низьких концентраціях виявляти різноманітну біологічну дію. Вітаміни потрібні у невеликих кількостях для забезпечення нормального обміну речовин, фізіологічних функцій та життєдіяльності живих організмів [1]. Організм людини не синтезує вітаміни, тому основна їх кількість надходить до нього з їжею (з рослинними чи тваринними продуктами) або при прийомі таблеток. Лише деякі вітаміни синтезуються мікрофлорою кишківника, але ця кількість не завжди задовольняє потреби організму [2].

Вітаміни групи D включають в себе кілька сполук, відомих як вітамін D1 (кальциферол), D2 (ергокальциферол), D3 (холекальциферол). Вітаміни D1 і D2 синтезуються рослинами при дії ультрафіолетового випромінювання, а вітамін D3 утворюється в шкірі людини під впливом сонячних променів. Попередник вітаміну D2 – ергостерин синтезується дріжджами. Вітамін D3 – холекальциферол виділяють із тканин тварин, його провітамін – 7- дегідрохолестерин [3].

Вітамін D2 використовують для профілактики та лікування гіповітамінозу D, рахіту, захворювань кісток, зумовлених порушенням обміну кальцію (остеопороз та остеомаляція), при порушеннях функцій паращитовидних залоз, туберкульозу шкіри та кісток, системному черевному вовчаку шкіри і слизових оболонок [4].

Працюючі, що протягом тривалого часу знаходяться поза впливом сонячних променів (шахтарі, працівники метрополітену, підводники та ін.), повинні піддаватися систематичному дозованому опроміненню у фотаріях, забезпечуватися харчуванням підвищеної D-вітамінної активності або, як альтернативу цьому, приймати препарат «Ергокальциферол (Вітамін D2)» [5].

На території України є лише два підприємства, що виробляють «Ергокальциферол (Вітамін D2)» це: ПрАТ «Технолог» та ВАТ «Вітаміни». Обидва підприємства знаходяться в місті Умань Черкаської області [4]. У зв’язку з цим виникає необхідність побудови цеху на одному з діючих фармацевтичних підприємств (наприклад, на ПрАТ «Біофарма») для додаткового виробництва цього препарату.

Метою даної роботи є проектування ділянки виробництва (апаратурна і технологічна схеми) субстанції ергокальциферолу дріжджами Saccharomyces cerevisiae YEH56 (pHXA42) у вигляді сухих кристалів ергостерину для подальшого їх очищення та пакування в поліетиленові пакети.

Актуальність теми. Ергостерин є попередником сполук, які мають D – вітамінну та гормональну активність, тому ергостерин дріжджів становить інтерес для вирішення проблеми гіповітамінозів групи D та лікування захворювань кісток у дітей та дорослих, що є гострим питанням у багатьох країнах світу, у тому числі й в Україні [6].

Новизна. Біологічний агент Saccharomyces cerevisiae YEH56 (pHXA42) є

продуктивним продуцентом ергостерину − концентрація цільового продукту становить 1,7 г/л. Як ростовий субстрат використовується дешева сировина меляса. Культивування з вуглеводним підживленням дає змогу підвищити концентрацію ергостерину. Метод виділення цільового продукту дозволяє збільшити вихід ергостерину до 90 % [7].

5.2. Рекомендації до оформлення розділів випускового кваліфікаційного дипломного проекту

Розділ 1. Характеристика цільового продукту. Характеристика кінцевої продукції виробництва (в загальному вигляді) включає назву препарату (продукції) відповідно до затвердженого на цей продукт нормативнотехнічного документа − ДСТУ, ГОСТ, ОСТ, ГСТУ, ТУ, АНД. Наводиться сукупність фізико-хімічних властивостей даного продукту мікробного синтезу (наприклад, структурна та хімічна формула, молекулярна маса, температура

16

розкладання, плавлення та кипіння, розчинність, інтенсивність поглинання, активність, механізм біологічної дії, фармакокінетика, фармакодинаміка тощо), вказуються галузі практичного використання біологічно активної речовини.

Зверніть увагу! Цей розділ включає відомості з попередніх курсових робіт (дисципліна «Загальна мікробіологія та вірусологія» [4] та «Технології мікробного синтезу лікарських засобів»[5], 3-й курс).

Розділ 2. Обґрунтування вибору та характеристика біологічного агента.

Зверніть увагу! Цей розділ включає відомості з попередніх курсових робіт (дисципліна «Загальна мікробіологія та вірусологія» [4] та «Технології мікробного синтезу лікарських засобів»[5], 3-й курс).

2.1. Обґрунтування вибору біологічного агента та поживного середовища для його культивування.

У цьому підрозділі аналізуються мікроорганізми, що використовуються як продуценти певної біологічно активної речовини, їх недоліки та переваги. На основі цього аналізу пропонується біологічний агент, який порівняно з іншими має ті чи інші переваги (наприклад, здатність до надсинтезу біологічно активної речовини, можливість культивування на простіших та дешевших середовищах, стійкість до контамінації, вищу швидкість росту чи синтезу цільового продукту тощо).

З метою аналізу і систематизації знайденої сучасної наукової, науковотехнічної та патентної літератури і для вибору найефективнішого біологічного агента студент під час виконання цього розділу складає три таблиці (складені під час виконання курсової роботи з дисципліни «Технології мікробного синтезу лікарських засобів» [5]).

У табл. 1 наводяться такі дані про кілька відомих з літературних даних найактивніших біологічних агентів (графи таблиці):

-біологічний агент (назва і номер штаму);

-склад поживного середовища;

-показники синтезу: концентрація цільового продукту і біомаси, ферментативна активність тощо;

-тривалість процесу;

-особливості технологічного процесу (двостадійний, регуляція рН, дробне внесення субстрату тощо);

-використана література.

На наступному етапі на основі аналізу даних, наведених у табл. 1, розраховується вартість поживних середовищ, використовуваних для вирощування найактивніших біологічних агентів. Результати розрахунків оформлюються у вигляді табл. 2, яка включає такі графи:

-біологічний агент (назва і номер штаму);

-концентрація кожного компонента поживного середовища (г/л), використовуваного для вирощування певного біологічного агента;

17

-ціна компонента поживного середовища (грн/кг);

-вартість компонента (грн.) для приготування 1 л середовища;

-джерело інформації (прайс-лист, електронний ресурс) про ціну компонентів поживного середовища із вказанням дати, станом на яку

наведено ціну.

На заключному етапі виконання розділу на основі даних, наведених у табл. 1 і табл. 2, студент складає узагальнюючу таблицю (табл. 3), в якій наводяться такі дані (графи):

-біологічний агент (назва і номер штаму);

-вартість 1 л середовищ (грн.);

-концентрація цільового продукту (г/л, мг/л) чи активність (ферментативна, антибіотична);

-умовна вартість 1 г (мг) цільового продукту (грн/г, грн/мг) чи одиниці активності (грн/од);

-тривалість культивування;

-концентрація цільового продукту, синтезованого за год.

На основі наведених у табл. 3 даних, студент обирає найефективніший

біологічний агент, використовуваний для біосинтезу певного цільового продукту.

2.2. Морфолого-культуральні та фізіолого-біохімічні ознаки біологічного агента

Приклад 8. Морфолого-культуральні та фізіолого-біохімічні ознаки Еnterococcus faecium DSH20 – продуцента бактеріоцину

Клітини штаму Е. faecium DSH20 являють собою грампозитивні нерухливі коки діаметром 0,5 мкм, розташовані поодиноко, по два або у вигляді груп. Не утворюють спор. Для ентерококів характерні різкі відмінності як за формою, так і за розмірами. На чашках з агаризованим середовищем МРС через 24 год росту при 37 °C утворює блискучі сіруватобілі колонії округлої форми з рівними краями, опуклі з гладкою поверхнею діаметром ~ 0,5 мм, через 48 год росту діаметр колонії досягає 1 мм. На поверхні щільних середовищ утворюють дрібні, круглі, опуклі, гомогенні колонії, які добре заломлюють світло, злегка голубуваті, а іноді мутнуваті. [31, 60, 73].

Штам росте в аеробних, мікроаерофільних та анаеробних умовах. Температурний діапазон росту 10–45 °С. Ентерококи зберігають життєздатність при нагріванні до 60 °С протягом 30 хв. Оптимальне значення pH середовища для росту штаму 6,5. Використовує вуглеводи як джерело вуглецю та енергії. В анаеробних умовах утворює молочну кислоту у результаті гомоферментативного молочнокислого бродіння. Стійкий до впливу хлору і підвищених концентрацій солей. Резистентний до антибіотиків (пеніциліну, стрептоміцину, поліміксину та ін.). Ентерококи лізуються специфічним фагом. Не росте на середовищах з 0,04% телуриту, з 0,1% розчином метиленового синього, не утворює пігментів і каталази, гідролізує аргінін, не притаманна гемолітична активність, не утворює кислот під час росту на ксилозі, рамнозі, рафінозі та гліцерині. Утворює молочну кислоту з сахарози та лактози [31,

60, 73].

Якщо як біологічний агент використовується мутантний або рекомбінантний штам, необхідно навести спосіб його одержання і пояснити, для чого (з якою метою) це робили. Крім того, властивості мутантного або

18

генно-інженерного штаму (зокрема, його фізіолого-біохімічні властивості) відрізняються від таких у вихідного штаму. У дипломі наводяться

властивості конкретного використовуваного для біосинтезу цільового продукту штаму.

Якщо упродовж досліджень назву штаму було змінено, бажано навести «історію» таких змін.

Приклад 9. Приклад наведення фрагменту характеристики біологічного агента з історією зміни назви мікроорганізму.

Streptomyces mediterranei – продуцент рифампіцину був вперше виділений в 1957 р. з грунту поблизу міста Святого Рафаеля на півдні Франції. Штам був ідентифікований мікробіологами з італійської фармацевтичної компанії в Мілані [5].

У 1969 р. було встановлено, що клітинна стінка цих бактерій типова для представників роду Nocardia, тому продуцент був перейменований на Nocardia mediterrane. У 1986 р. назву було змінено на Amycolatopsis mediterranei (перший вид нового роду), так як вчений Лешевалье виявив, що у клітинній стінці відсутні міколові кислоти і бактерії, на відміну від представників родів Nocardia та Rhodococcus, не піддаються ураженню фагами

[5].

Розділ 3. Техніко-економічне обґрунтування Зверніть увагу! Цей розділ включає відомості з курсового проекту

(дисципліна «Основи проектування біотехнологічних виробництв» [2], 4-й курс).

На основі літературних даних щодо потреби у цільовому продукті і даних розділу 2 щодо біосинтетичної здатності біологічного агента розраховується (з урахуванням втрат) потужність виробництва (у м3 культуральної рідини).

Зверніть увагу! У літературі, що стосується технологій одержання пробіотиків, бактеріальних добрив та ін. часто вказують не концентрацію біомаси, а КУО/мл (кількість живих клітин (колоніє-утворюючих одиниць) в 1 мл культуральної рідини). У цьому разі слід розрахувати концентрацію біомаси на основі вмісту джерела азоту у середовищі культивування продуцента. Приклади таких розрахунків наведено у методичних рекомендаціях до виконання курсової роботи з дисципліни «Загальна мікробіологія і вірусологія» [4]. У разі використання натуральних середовищ (середовищ невизначеного складу) для культивування молочнокислих бактерій, приймають концентрацію

біомаси (Хкр, г/л) від 3 до 6.

У літературі, що стосується технологій одержання антибіотиків і гідролітичних ферментів інколи наводять не концентрацію цільового продукту (в г/л культуральної рідини), а активність (од/мл). Для спрощення розрахунків у цьому разі приймають середню концентрацію такого цільового продукту в культуральній рідині (Ркр, г/л) від 1 до 2 г/л.

Дані щодо потреби у цільовому продукті доцільніше наводити у вигляді узагальнюючої таблиці.

19

Приклад 10. Потреба у цільовому продукті (ергокальциферолі)

Примітка. Дані щодо посівних площ на сезон 2013–2014 року в Україні наведено згідно Державної служби статистики [http://ukrstat.org/uk Публікація документів Державної служби Статистики України].

20