Материал: Melnuchuk_Promuslova biotexnologij

РОЗДІЛ 2. ОСОБЛИВОСТІ ОРГАНІЗАЦІЇ ПЕРЕДФЕРМЕНТАЦІЙНОЇ СТАДІЇ БІОТЕХНОЛОГІЧНИХ ВИРОБНИЦТВ

Завдання. Результати досліду записати в таблицю і замалювати. Зробити висновки про необхідність різних живильних елементів для нормального росту гриба Aspergillus niger і про особливості розвитку гриба при відсутності і при додатковому внесенні певного елементу живлення.

Контрольні питання:

1.Які органічні кислоти синтезуються мікроміцетами?

2.Який механізм синтезу органічних кислот у грибів?

3.Як впливає концентрація заліза у живильному середовищі на синтез лимонної кислоти?

4.Як впливають мікрота мікроелементи на ріст та розвиток Aspergillus niger ?

36

РОЗДІЛ 3. ВИВЧЕННЯ ВПЛИВУ УМОВ КУЛЬТИВУВАННЯ НА ФІЗІОЛОГІЧНУ АКТИВНІСТЬ ПРОДУЦЕНТІВ

клітини. Для виділення чистої культури використовують, як правило, щільні живильні середовища, на яких кожна клітина виростає у вигляді ізольованої колонії - потомства мікроорганізмів, що утворилося з однієї клітини.

Чисті культури мікроорганізмів (дріжджів, мікроскопічних грибів, молочнокислих, оцтовокислих, пропіоновокислих та інших бактерій) володіють промислово цінними властивостями і потрібні для отримання різних продуктів і речовин, що знайшли застосування в харчовій промисловості та інших галузях народного господарства.

Для виділення чистих і накопичувальних культур з різних об'єктів в лабораторіях використовують методи посіву та пересіву. Посівом називається внесення частини досліджуваного матеріалу в стерильне живильне середовище, пересівом - перенесення частини вирослої на живильному середовищі культури мікроорганізмів на інше свіже живильне середовище.

Культивування - вирощування мікроорганізмів на живильних середовищах. При культивуванні на живильних середовищах виростають культури мікроорганізмів. Ріст культури - фізіологічний процес, в результаті якого збільшується біомаса - маса клітинної речовини даного мікроорганізму.

Для успішного вирощування мікроорганізмів необхідно забезпечити оптимальні умови культивування, які залежать від їх фізіологічних особливостей. До таких умов відносять: склад поживного середовища, аерацію, температуру та інші специфічні фактори.

Інтервали температур, при яких можуть рости мікроорганізми суттєво відрізняються. Для оптимального розвитку мікроорганізмів необхідна температура, відповідна видовим потребам культури. Більшість видів бактерій активно розмножується при температурі 36-37°С, міцеліальні гриби - при 25-З0°С. Це мезофільні мікроорганізми.

Холодолюбиві (психрофільні) мікроорганізми розвиваються при температурі в межах від 0 до 20°С. Для теплолюбивих (термофільних) мікроорганізмів оптимальна температура росту 45-65°С. При відхиленні температури від оптимальної розвиток мікроорганізмів затримується. Тому їх вирощують у спеціальних термостатах - шафах з термоізоляцією, в яких підтримується постійна температура, відповідна потребам культур. Температура у термостаті автоматично регулюється за допомогою спеціального обладнання – терморегулятора, який підтримує її на постійному рівні. Термостат – це металевий прилад із подвійними стінками, між якими знаходиться повітря або вода. В отворі верхньої стінки знаходиться термометр, який показує температуру в середині термостата, і терморегулятор. Роль терморегулятора полягає в тому, що при перевищенні встановленого рівня температури, обігрів автоматично виключається або зменшується.

38

РОЗДІЛ 3. ВИВЧЕННЯ ВПЛИВУ УМОВ КУЛЬТИВУВАННЯ НА ФІЗІОЛОГІЧНУ АКТИВНІСТЬ ПРОДУЦЕНТІВ

Потреби у вільному кисні у мікроорганізмів неоднакові. Мікроорганізми аероби і факультативні анаероби вирощують при доступі кисню в звичайних умовах повітряного середовища.

Культивування анаеробів виробляється в безкисневих умовах, які створюються різними прийомами. Найбільш простий спосіб - механічний захист мікроорганізмів від повітря шляхом вирощування їх у високому шарі рідкого середовища (у пробірці до 10-15 мл). Для цього поверхню середовища заливається тонким шаром стерильного вазелінового масла або парафіну. Дифузія кисню з повітря в рідкі середовища зменшується при загущенні середовища агар-агаром (0,2-0,3%). При використанні щільних середовищ посів здійснюється в чашках Петрі під шаром агару. Строгі анаеробні мікроорганізми вирощують в спеціальних апаратах - скляних вакуумних ексикаторах або анаеростатах.

За відношенням мікроорганізмів до кисню їх умовно розподіляють на:

-аероби – життєдіяльність яких відбувається за рахунок окислення речовин киснем повітря;

-анаероби – отримують кисень при анаеробному розщепленні складних органічних сполук. Атмосферний кисень при цьому смертельний;

-мікроаерофіли (факультативні аероби та анаероби) – потребують умов із зниженим рівнем кисню.

Терміни культивування. Відповідно до закономірностей росту більшість культур бактерій вирощують протягом 24-48год. Мікроскопічні гриби культивують протягом тижня.

Робота № 5. Методи виділення накопичувальних культур мікроорганізмів

До таких методів відносяться методи збагачення, метод нагрівання для виділення спороутворюючих бактерій, метод виділення рухомих форм бактерій (метод Шукевича) та ін. Одними з методів, що застосовують у промисловій біотехнології є:

1) Методи збагачення. Їх часто застосовують для виділення чистих культур мікроорганізмів з матеріалів, у яких мало бажаних мікроорганізмів, але міститься велика кількість супутньої мікрофлори. Для збільшення чисельності потрібного виду мікроорганізмів спочатку роблять посів досліджуваного матеріалу в накопичувальні живильні середовища, які містять речовини, що стимулюють його ріст і пригнічують або затримують розмноження супутньої мікрофлори. Наприклад, при виділенні культур молочнокислих бактерій з ґрунту, сирого молока або рослин посіви роблять на стерильне знежирене молоко, що містить 5% етилового спирту для пригнічення росту патогенних бактерій.

39

РОЗДІЛ 3. ВИВЧЕННЯ ВПЛИВУ УМОВ КУЛЬТИВУВАННЯ НА ФІЗІОЛОГІЧНУ АКТИВНІСТЬ ПРОДУЦЕНТІВ

2) Метод нагрівання. Застосовують для виділення чистих культур спорових форм бактерій (бацил). У цьому випадку перед посівом досліджуваний матеріал прогрівають на водяній бані при температурі 75 ...

85°С протягом 2030 хв. Вегетативні форми гинуть під час прогрівання, а спори мікробів залишаються живими і при подальших висівах на щільне середовище проростають, формуючи колонії.

Мета роботи: приготування середовища Ешбі та отримання накопичувальної культури Azotobacter chroococcum, яку використовують в якості основи для приготування бактеріальних добрив.

Хід виконання роботи:

1.Для одержання азотфіксуюючих бактерій використовують селективне безазотне середовище Ешбі наступного складу, г/л:

-K2HPO4 – 0,2

-MgSO4 × 7H2O – 0,2

-NaCl – 0,2

-K2SO4 – 0,1

-глюкоза (або манніт) – 20,0

-крейда – 5,0

-агар-агар – 20,0.

2.Стерильне середовище Ешбі розливають в чашки Петрі.

3.На поверхні застиглого середовища розкладають грудочки родючого ґрунту, після чого термостатують за t0 = 25–280C.

4.Через 4–5 діб навкруги деяких ґрунтових грудочок з’являються ослизненні колонії азотобактера. В тому випадку, коли колонії належать до виду Azotobacter chroococcum, вони з часом набувають бурого забарвлення.

5.З колоній виготовляють мазок та розглядають його під мікроскопом.

Робота № 6. Методи виділення чистих культур мікроорганізмів

Найбільш поширеним способом виділення чистих культур є непрямі методи, засновані на ізоляції однієї мікробної клітини від маси мікроорганізмів і наступному вирощуванні потомства цієї клітини на поживних середовищах ізольовано від інших видів.

Для посіву частіше використовуються агаризовані поживні середовища в чашках Петрі. Цей метод запропонований відомим німецьким мікробіологом Кохом і називається методом пластинчастих (або чашкових) культур Коха.

Основним завданням методу є розведення концентрації мікроорганізмів у досліджуваному матеріалі з таким розрахунком, щоб

40