Материал: Melnuchuk_Promuslova biotexnologij

РОЗДІЛ 2. ОСОБЛИВОСТІ ОРГАНІЗАЦІЇ ПЕРЕДФЕРМЕНТАЦІЙНОЇ СТАДІЇ БІОТЕХНОЛОГІЧНИХ ВИРОБНИЦТВ

2.Для приготування м’ясо-пептонного агару (МПА)

використовують виготовлену промисловим способом суміш, що містить усі компоненти і характеризується стандартністю, стабільністю та простотою приготування. До його складу входять, г/л:

– гідролізат м’яса або риби – 17,9;

– пептон – 10,0;

– NaCl – 5,0;

– агар-агар – 20,0.

Указану в інструкції кількість сухого порошку слід розмішати в колбі з 1000 мл холодної дистильованої води. Перевірити рН за допомогою індикаторного паперу й за необхідності довести його до 7,2–7,4 розчином NaOH. Потім, при постійному перемішуванні, довести розчин до кипіння та до повного розчинення інгредієнтів.

Отримане середовище профільтрувати в гарячому вигляді через ватно-марлевий фільтр. Стерилізувати при 121°С (при 1 атм в автоклаві) протягом 15–20 хв.

3.Для приготування пептонної води до дистильованої води необхідно додати 1% пептону та 0,5% NaCl або розчинити в дистильованій воді стандартну суміш, виготовлену промисловим способом. Встановити значення рН на рівні 7,2–7,4 розчином NaOH. У разі застосування стандартного середовища, суміш прокип’ятити упродовж 3 хв. Потім розчин профільтрувати через паперовий фільтр і простерилізувати при 121°С (при 1 атм в автоклаві) упродовж 30 хв.

4.Для приготування картопляного агару 200 г картоплі (добре помитої та очищеної) подрібнити, залити 1 л водогінної води, кип’ятити 15 хв. Відвар профільтрувати через ватно-марлевий фільтр, довести об’єм водогінною водою до початкового рівня, додати 0,2% NaCl та 2% агарагар. Нагріти, постійно перемішуючи, до повного розплавлення агару, за необхідності знову профільтрувати. Установити значення рН на рівні 7,0. Середовище простерилізувати при 121°С (при 1 атм в автоклаві) упродовж

30хв.

5.Для приготування синтетичного середовища Чапека в 1 л дистильованої води розчинити солі, виміряти рН, за необхідності довести значення рН до рівня 5,0–6,0, додати агар-агар, витримати протягом 15–20 хв. для його набухання і одержане середовище довести до кипіння при постійному перемішуванні. Профільтрувати гарячим через ватно-марлевий

фільтр, додати CaCO3 (крейду) за прописом та розлити у флакони для стерилізації. Середовище простерилізувати при 116,5°С (при 0,75 атм в автоклаві) 10 хв.

Компоненти середовища, г/л:

–NaNO3 – 2,0

–KH2PO4 – 1,0

–KCl – 0,5

–MgSO4 ×7H2O – 0,5

31

РОЗДІЛ 2. ОСОБЛИВОСТІ ОРГАНІЗАЦІЇ ПЕРЕДФЕРМЕНТАЦІЙНОЇ СТАДІЇ БІОТЕХНОЛОГІЧНИХ ВИРОБНИЦТВ

–FeSO4 ×7H2O – 0,01

–сахароза або глюкоза – 0,03

–CaCO3 – 3,0

–агар-агар – 20,0.

6.Уважно розгляньте характер росту різних бактерій на рідких, напіврідких і щільних поживних середовищах, використовуючи готові демонстраційні посіви.

7.Опишіть і замалюйте ріст бактерій на різних поживних середовищах.

8.Зробіть посів бактерій на рідких, напіврідких і щільних поживних середовищах.

Контрольні питання:

1.Назвіть макрота мікроелементи, які повинно містити живильне середовище.

2.Що таке фактори росту та за яких умов їх додають у живильне середовище?

3.На які групи поділяють мікроорганізми в залежності від джерела вуглецю?

4.Що являє собою агар-агар та які його фізичні характеристики?

5.Чому желатин має обмежене використання для ущільнення живильних середовищ?

6.Яким вимогам повинні відповідати живильні середовища?

7.Як класифікують живильні середовища в залежності від походження, призначення та консистенції?

Робота № 4. Значення живильних елементів для росту Aspergillus niger. Культура цвілевих грибів на повному і неповному живильних середовищах

Для вивчення особливостей живлення мікроорганізмів зручним модельним об'єктом є Aspergillus niger, який легко отримати і використовувати в постановці різних експериментів, у тому числі для визначення значення окремих мінеральних елементів для росту (рис.9).

Умови культивування. Пліснявий гриб A. niger добре засвоює глюкозу, фруктозу, сахарозу, погано - галактозу, лактозу. Найбільша кількість ЛК (лимонної кислоти) утворюється при зброджуванні середовищ, що містять сахарозу. Оптимальна концентрація цукру в середовищі складає 10-15%.

Бурякова меляса, використовувана у виробництві ЛК, містить 7082% сухих речовин (42-49% сахарози) і має рН в діапазоні 6-9. Меляса, одержувана при переробці тростинного цукру-сирцю, містить близько 80% сухих речовин, в тому числі близько 44% зброджується цукрів, рН =6,5.

Процес утворення ЛК при ферментації цукру може бути представлений наступним рівнянням:

32

РОЗДІЛ 2. ОСОБЛИВОСТІ ОРГАНІЗАЦІЇ ПЕРЕДФЕРМЕНТАЦІЙНОЇ СТАДІЇ БІОТЕХНОЛОГІЧНИХ ВИРОБНИЦТВ

С12Н22О11 + 3О2 → 2С6Н8О7 + 3Н2О

Як джерело азоту, як правило, використовуються амонійні солі:

(NH4)2SO4, NH4Cl і NH4NO3.

Масова частка азоту в середовищі повинна знаходиться в межах 0,1- 0,2 мас. %.

Найбільш ефективними джерелами фосфору є KН2РО4 і K2НРО4, що є і джерелом калію. Однак надлишок фосфат-іонів чинить негативний вплив на біосинтез ЛК.

Рис. 9. Утворення органічних кислот мікроміцетами

(за Пирог Т.П., Ігнатова О.А., 2009)

Масова частка фосфору в розрахунку на Р2О5 повинна бути при поверхневому культивуванні 0,025, а при глибинному - 0,08 мас. %. Вміст сірки має бути близько 0,07 мас. %.

При високих концентраціях іонів заліза зростає швидкість перетворення ЛК в ізолимонну кислоту. У відсутності іонів заліза слабо розвивається міцелій. Тому необхідно підтримувати концентрацію іонів заліза в межах 0,3-1,5 мг / л.

Важливе значення для біосинтезу відіграють інші мікроелементи, оптимальна концентрація яких становить, мг/л: Cu2 + - 0,5-3,0 (в розрахунку на CuSO4 · 5H2O), Zn2 + - 0,14, Mn2 + - 0,02.

Мета роботи: вивчити значення поживних елементів для росту гриба

Aspergillus niger.

Обладнання та матеріали: 20%-й розчин сахарози; 1%-е розчини ZnSO4,

Н3ВO3, МnSO4; 10%-ні розчини NН4NO3, КН2РO4, КС1, NаН2РО4, МgSO4,

МgС12, FеSO4, FеСl3, Nа2SO4; колби ємністю 100 мл; циліндри ємністю 100 мл; піпетки на 10 і 1 мл; препарувальні голки; вата.

Хід роботи:

33

РОЗДІЛ 2. ОСОБЛИВОСТІ ОРГАНІЗАЦІЇ ПЕРЕДФЕРМЕНТАЦІЙНОЇ СТАДІЇ БІОТЕХНОЛОГІЧНИХ ВИРОБНИЦТВ

Готують різні поживні середовища для культивування гриба Aspergillus niger.

Варіант 1 - повне живильне середовище без мікроелементів,%: сахароза - 10,0; NН4NO3 - 0,3; КН2РО4 - 0,2; МgSO4 - 0,05; FеSO4 - 0,01.

Варіант 2 - середовище без вуглецю: виключена сахароза. Для компенсації осмотичної активності середовища можна внести відповідну по осмотичного еквіваленту кількість хлориду натрію (NаС1), яка не впливає на розвиток Aspergillus niger.

Варіант 3 - середовище без азоту: виключений NН4NO3. Варіант 4 - середовище без фосфору: КН2РО4 замінений

еквівалентною кількістю КС1.

Варіант 5 - середовище без калію: КН2Р04 замінений еквівалентною кількістю NаН2РО4.

Варіант 6 - середовище без сірки: МgSO4 та FеSO4 замінені еквівалентними кількостями МgС12 і FеСl3.

Варіант 7 - середовище без магнію: МgSO4 замінений еквівалентною кількістю Nа2SO4.

Варіант 8 - середовище без заліза: FеSO4 замінений еквівалентною кількістю Nа2SO4.

Варіант 9 - повне живильне середовище з додаванням цинку:

ZnSO4 - 0,01%.

Варіант 10 - повне живильне середовище з додаванням марганцю: МnSO4 - 0,01%.

Варіант 11 - повне живильне середовище з додаванням бору: Н3ВО3 - 0,01%.

Слід розрахувати еквівалентний відсоток заміненої речовини (це відноситься до всіх варіантів, за винятком перших трьох). Якщо в кожному з цих варіантів виключити певну сіль, то одночасно видаляються два елементи живлення замість одного. Так, у варіанті № 4 (середовище без фосфору) при видаленні КН2РО4 одночасно видаляється фосфор і калій. Тому калій необхідно внести в середовище в еквівалентній кількості у вигляді КС1. Крім того, необхідно пам'ятати, що Aspergillus niger є аеробним організмом, тому для створення оптимальних умов аерації використовують колби ємністю 100 мл з 30 мл середовищем.

Приклад розрахунку

Варіант 4 - середовище без фосфору: КН2РО4 (0,2% в середовищі) замінюють на КС1. Молекулярна маса КН2Р04 - 136, КС1 - 74.Спочатку визначають вміст (у%) калію (х) в середовищі:136 г КН2РО4 складають 0,2%; 39 г К - х%; х = 0,06%. Потім встановлюють кількість КС1 (в %), еквівалентну вилученій кількості КН2РО4:

39 г К відповідають 0,06% К; 74 г - у% КС1;у = 0,1%.

Далі розраховують кількість кожної речовини в грамах в 30 мл середовища, знаючи їх процентний вміст.

34

РОЗДІЛ 2. ОСОБЛИВОСТІ ОРГАНІЗАЦІЇ ПЕРЕДФЕРМЕНТАЦІЙНОЇ СТАДІЇ БІОТЕХНОЛОГІЧНИХ ВИРОБНИЦТВ

Приклад розрахунку.

Необхідний розчин, концентрація в якому NН4NO3 0,3%:

в100 мл розчину міститься 0,3 г NН4NO3;

в30 мл - х г NН4NO3;

х= 0,09 м.

Таким же чином розраховують наважки усіх інших компонентів середовища. Так як наважки у більшості своїй дуже малі, що ускладнює зважування, зручніше використовувати готові розчини: 20%-й розчин сахарози; 1%-й розчин мікроелементів; 10%-ні розчини всіх інших солей. Для цього слід визначити, скільки мл кожного розчину треба взяти, щоб внести відповідну наважку.

Приклад розрахунку. Для NН4NO3:

в10 мл 10%-го розчину NН4NO3 міститься 10 г NН4NO3;

ву мл 10%-го розчину NН4NO3 - 0,09 г NН4NO3;

у = 0,9 мл.

Подібним чином розраховують (в мл) усі інгредієнти для кожного варіанту і вносять їх в колбу. Підсумувавши об'єми розчинів в кожному варіанті, віднявши отриману суму з 30 мл, отримують кількість дистильованої води, яку необхідно додати в кожну колбу. Колби із середовищем заражають спорами гриба Aspergillus niger, закривають ватними пробками і підписують варіанти досліду. Середовища перед внесенням спор гриба не стерилізують, оскільки висока концентрація цукру і кисла реакція середовища за рахунок кислих солей калію, магнію і заліза перешкоджають росту бактерій. Для кожного варіанту дослід бажано повторити двічі. Досліджені колби розміщають в термостат при 2830°С. Матеріал аналізують через сім днів, так як до цього часу міцелій активно розростається по середовищу. Плівка, що виросла в першому варіанті, приймається як зразок, з нею порівнюють всі інші. Зазвичай в цьому варіанті ріст гриба дуже активний. Ріст гриба оцінюють візуально. Відзначають стан культури гриба:

а) характер міцелію - суцільна плівка або острівцями, щільна або драглиста, складчаста або гладка; б) спороношення - сильне або слабке, зрілі чи незрілі спорангії.

Для більш точної оцінки плівку гриба ретельно промивають з нижньої сторони водою. Потім плівку з кожного варіанту досліду можна висушити в сушильній шафі при 105°С до постійної маси і зважити, приймаючи вагу плівки гриба в першому варіанті за 100%. На середовищах, де виключений той чи інший елемент живлення (особливо при великій потребі в ньому), гриб не росте або росте дуже слабо. При повному видаленні з живильного середовища необхідного елемента гриб розвиватися не буде.

35