Материал: Melnuchuk_Promuslova biotexnologij

РОЗДІЛ 2. ОСОБЛИВОСТІ ОРГАНІЗАЦІЇ ПЕРЕДФЕРМЕНТАЦІЙНОЇ СТАДІЇ БІОТЕХНОЛОГІЧНИХ ВИРОБНИЦТВ

2.2. Хімічні методи стерилізації: дезінфекція антисептиками

Хімічна стерилізація (дезінфекція) – це знищення мікроорганізмів та їх спор за допомогою хімічних речовин (антисептиків). Найчастіше дезінфекцію проводять для знищення патогенних форм мікроорганізмів у навколишньому середовищі.

Знеорганічних сполук сильнодіючими є солі важких металів.

Бактерицидну дію проявляють окислювачі Cl2, I2, Н2О2, КМnО4, H2SO4, HCl, H2S, CO2, SO2.

а. Галогени (хлор, йод) та їх похідні. Хлор та йод активні проти вегетативних та спорових форм мікроорганізмів.

б. Сполуки важких металів (ртуть, срібло, мідь). Так як сполуки ртуті високотоксичні, а срібла – затратні, їх використовують дуже рідко. Крім того, ці сполуки здійснюють переважно бактеріостатичну (затримують ріст і розвиток мікроорганізмів), а не бактерицидну дію (викликають загибель).

Зорганічних сполук отруйні для мікроорганізмів феноли, альдегіди, спирти, органічні кислоти (саліцилова, оцтова, бензойна, сорбінова), ефірні олії, смоли, барвники (генціанвіолет, фуксин, діамантова зелень).

а. Фенольні сполуки. Феноли здійснюють дезінфікуючий вплив як на вегетативні клітини, так і на спори, тоді як їх сполуки неефективні проти спор.

б. Спирти (етиловий та ізопропіловий). Їх дезінфікуючі властивості зростають прямо пропорційно концентрації, від 500 до 700. При більш високих концентраціях їх бактерицидна дія різко знижується. Спирти не здійснюють летального впливу на спори бактерій і мають повільний дезінфікуючий ефект (декілька хвилин).

в. Цидні гази. Формальдегід – максимальний стерилізаційний ефект досягається при вологості повітря 70% і температурі 220 С. При більш низькій температурі він втрачає свій дезінфікуючий ефект. Оксидом етилену обробляють термолабільні середовища та пластмасовий посуд.

Оксид етилену летка сполука і виділяється з обробленого матеріалу при температурі 370 С.

г. Консерванти додають до середовищ та матеріалів, які підлягають тривалому зберіганню.

Ефективність дії антисептиків залежить від природи речовини, концентрації, біологічних особливостей мікроорганізмів, тривалості впливу, температури, рН та складу середовища. Більш чутливі до антисептиків вегетативні клітини, ніж спори.

Механізм дії антисептиків різний:

• пошкодження клітинної стінки і порушення мембрани;

• порушення обміну речовин в результаті взаємодії з компонентами клітини після проникнення в неї;

• вплив на білки, ферменти;

21

РОЗДІЛ 2. ОСОБЛИВОСТІ ОРГАНІЗАЦІЇ ПЕРЕДФЕРМЕНТАЦІЙНОЇ СТАДІЇ БІОТЕХНОЛОГІЧНИХ ВИРОБНИЦТВ

•розчинення ліпідів клітинних мембран;

•зміна рН середовища.

Окремо можна виділити біологічну стерилізацію, яку здатні здійснювати антибіотичні речовини та фітонциди.

У промисловості для стерилізації робочих апаратів часто використовують пар з високою температурою.

Використовувані для культивування середовища стерилізують в залежності від їх складу: стійкі до нагрівання - при високих температурах (нагрівання, пара), для нестійких компонентів може бути використано фільтрування.

Вимірювальні прилади найчастіше стерилізують хімічно, змиваючи залишки хімічних речовин стерильною водою.

Робота № 1. Методи стерилізації посуду та живильних середовищ

Стерилізація скляного посуду та інструментів.

Скляний посуд, вимитий, висушений і загорнутий в папір, стерилізують, в основному, гарячим повітрям у сушильних шафах при температурі 165-170°С протягом 2 год. Посуд можна стерилізувати і в автоклаві. Посуд розгортають безпосередньо перед використанням. Кожну піпетку загортають окремо в довгі смужки паперу шириною 4-5 см. Попередньо вставляють ватні кульки у кінці піпеток. Обмотування починають з протилежного кінця поступовим рухом паперу по спіралі. Папір повинна щільно охоплювати піпетку. Загорнуті піпетки загортають по кілька штук разом або поміщають в спеціальні металеві або картонні пенали. Шпателі обгортають окремо аналогічно піпеткам, використовуючи для обмотування смужки паперу більшої ширини.

Чашки Петрі загортають разом по 2-4 штуки. Колби, пробірки та інший посуд з середовищем закривають ватними корками, а зверху папером.

Дрібні металеві лабораторні предмети (пінцети, бактеріологічні петлі та ін.) під час роботи можна стерилізувати пропалюванням у полум'ї пальника (фламбування) безпосередньо перед використанням. На полум'ї також короткочасно обпалюють горлечка колб, пробірок, пляшок, ватні пробки при пересіві культур і розливі середовищ. У полум'ї спиртівки гинуть клітини і спори мікроорганізмів. Відпрацьовані піпетки з культурою опускають у дезінфікуючі розчини (наприклад, в 5%-ний розчин фенолу).

Мета роботи. Ознайомитися з організацією та обладнанням лабораторії промислової біотехнології, вимогами до стерилізації та дезінфекції. Навчитися готувати посуд, обладнання, поживні середовища до стерилізації та обирати необхідний метод стерилізації. Оволодіти технікою стерилізації.

22

РОЗДІЛ 2. ОСОБЛИВОСТІ ОРГАНІЗАЦІЇ ПЕРЕДФЕРМЕНТАЦІЙНОЇ СТАДІЇ БІОТЕХНОЛОГІЧНИХ ВИРОБНИЦТВ

Матеріали та обладнання: термостат; сушильна шафа; піпетки об’ємом 1 мл, 2 мл та 5 мл (по дві на кожного студента), піпетки об’ємом 1 мл, 2 мл та 5 мл (по дві на кожного студента), чашки Петрі (по дві на кожного студента), колби різних розмірів, скляні палички (по дві на кожного студента), бактеріологічні пробірки (по дві на кожного студента), металеві пінцети, бинти або марля, вата гігроскопічна, папір, нитки, сірники, ножиці.

Хід роботи:

М’ясо-пептонний бульйон (МПБ) розлити у 12 стерильних пробірок. Чотири пробірки кип’ятити 30 хв. Інші чотири – простерилізувати в автоклаві 15 хв. при 1 атмосфері. Останні чотири пробірки залишити без обробки. Після цього всі пробірки помістити у термостат при температурі 28–300С і спостерігати за ними протягом 4–5 діб, відмічаючи зміни, які відбуваються в пробірках.

Результати досліджень свідчать, що тільки після автоклавування живильне середовище надовго залишається стерильним. При інших методах обробки у пробірках спостерігається утворення плівок та каламуті внаслідок розмноження бактерій.

Оформлення результатів роботи.

1.Підготувати стерильний посуд до наступних занять.

2.Провести оцінку якості стерилізації живильного середовища в залежності від методів стерилізації, оформити у вигляді наступної таблиці

4.

Таблиця 4 Оцінка ефективності стерилізації поживного середовища в залежності від методів

стерилізації

Контрольні питання:

1.Які кімнати повинна містити лабораторія промислової біотехнології?

2.Які методи стерилізації ви знаєте?

3.Які режими використовують при стерилізації в автоклаві?

4.Яка будова автоклава?

5.У чому полягає суть хімічних методів стерилізації?

6.Що таке стерилізація, дезінфекція, пастеризація? Чим вони відрізняються між собою?

23

РОЗДІЛ 2. ОСОБЛИВОСТІ ОРГАНІЗАЦІЇ ПЕРЕДФЕРМЕНТАЦІЙНОЇ СТАДІЇ БІОТЕХНОЛОГІЧНИХ ВИРОБНИЦТВ

Робота № 2. Ефективність фізичних і хімічних методів стерилізації

Ряд біотехнологічних виробництв і окремі стадії отримання продукції з використанням біотехнологічних прийомів вимагають забезпечення асептичних умов.

Під асептичними умовами розуміють заходи, режими, що перешкоджають попаданню контамінантів. Терміном «контамінанти» позначають сторонню мікрофлору, мікроорганізми-забруднювачі. Під підтриманням і створенням асептичних умов в технології слід розуміти:

•забезпечення умов отримання чистих культур в лабораторії та спеціалізованих відділеннях (термостатах, камерах тощо);

•стерилізація, герметизація обладнання і комунікацій;

•спеціальні прийоми при введенні добавок, при посіві і при відборі

проб;

•стерилізація піногасників, поживних середовищ, повітря.

Під стерилізацією розуміють повне очищення будь-якого матеріального потоку, а також обладнання та комунікацій від життєздатних мікроорганізмів, їх спор.

Процеси, використання яких на практиці сприяє досягненню і підтримці асептичних умов, умовно можна розділити на дві групи: процеси, що знищують сторонню мікрофлору; процеси, що видаляють мікроорганізми з матеріального потоку.

При виборі методу стерилізації слід враховувати чутливість мікроорганізмів до застосовуваних факторів, а також їх чисельність, видову приналежність, вміст у них вологи, фізіологічну форму (вегетативна, спори), вік клітин спор, значення рН, хімічний склад, фізичні властивості середовища та його об’єм.

Цидна дія різноманітних методів стерилізації обумовлена пошкодженням біологічно важливих макромолекул клітини і, як наслідок, порушенням певних фізіологічних функцій. Так, загибель клітин при термообробці у вологому середовищі настає через денатурацію білків, і звільнення нуклеїнових кислот, інактивацію ферментів, пошкодження цитоплазматичної мембрани. При впливі на клітину сухого жару загибель відбувається в результаті активних окислювальних процесів і порушення клітинних структур.

Мета роботи: вивчення ефективності режимів стерилізації фізичними і хімічними методами. Об'єктами для обробки є суспензія декількох видів мікроорганізмів: бактерій, дріжджів, спори мікроміцетів, які піддаються впливу термічної обробки, опроміненню УФ - променями і впливу оцтової кислоти.

24

РОЗДІЛ 2. ОСОБЛИВОСТІ ОРГАНІЗАЦІЇ ПЕРЕДФЕРМЕНТАЦІЙНОЇ СТАДІЇ БІОТЕХНОЛОГІЧНИХ ВИРОБНИЦТВ

Хід роботи:

Для вивчення впливу величини температури на загибель мікроорганізмів:

1.Три пробірки з 10 мл вихідної суспензії поміщають по черзі на 15 хв. в автоклав і стерилізують, відповідно, при 0,5 атм (112 °С), при 1 атм

(121°С) і при 1, 5 атм (127°С).

2.Після стерилізації з дотриманням умов асептики стерильною піпеткою на 1 мл по одній краплі обробленої суспензії вносять на поверхню агаризованого середовища СА і МПА в чашки Петрі і шпателем рівномірно розподіляють по поверхні. Чашки підписують, перевертають і поміщають у термостат на 1-2 доби при 37 °С.

3.Слід визначити кількість клітин у вихідній суспензії. Для цього

зпробірки з вихідною суспензією береться 1 мл і вноситься в пробірку з 9 мл стерильної води, потім 1 мл розведеної суспензії розбавляється в 100 і 1000 разів. З цих пробірок по 1 краплі вносять суспензію на чашки Петрі з СА і МПА, розтирають шпателем, підписують і відправляють в термостат.

Для вивчення кінетики загибелі клітин одну пробірку з вихідною суспензією, поміщають на водяну баню і через кожні 15 хв. протягом години відбирають стерильною піпеткою (щоразу новою) краплю суспензії та вносять на агаризовані пластинки з СА і МПА в чашки Петрі. Розтирають краплю шпателем по поверхні середовища. Чашки підписують, перевертають і поміщають в термостат.

Для вивчення впливу дози опромінення з пробірок з вихідними суспензіями мікроорганізмів, стерильною піпеткою на поверхні чотирьох чашок з МПА і чотирьох чашок з СА вносять з дотриманням правил асептики по одній краплі суспензії. Розподіляють шпателем по поверхні.

Встановлюють вісім чашок під бактерицидною лампою на відстані 40 см. Через 10 хв. виймають перші дві чашки, наступні попарно з інтервалом 10 хв. Підписують, перевертають і встановлюють чашки Петрі в термостат.

Для вивчення впливу концентрації органічних кислот на мікроорганізми:

1.Використовують чотири пробірки з вихідною суспензією, в кожну з яких вносять крижану оцтову кислоту за схемою.

Схема внесення реагенту

2.Обережно збовтують вміст пробірок і залишають на 15 хв. Потім з кожної пробірки стерильними піпетками відбирають по одній краплі обробленої суспензії та наносять на aгаризоване

25