Материал: Melnuchuk_Promuslova biotexnologij

РОЗДІЛ 8. ОСОБЛИВОСТІ БІОСИНТЕТИЧНОЇ АКТИВНОСТІ ПРОДУЦЕНТІВ ПЕРВИННИХ ТА ВТОРИННИХ МЕТАБОЛІТІВ

Робота № 35. Отримання екзоферментів бактерій роду Pectobacterium

Позаклітинні ферменти, які продукують фітопатогенними бактеріями роду Pectobacterium, відносяться в основному до класів протеаз, целюлаз і пектиназ (зокрема, пектатліаз).

Мета роботи: Використовуючи різні штами бактерій роду Pectobacterium, виявити якісними методами продукцію позаклітинних ферментів целюлаз і протеаз. Визначити вплив катаболітної репресії (КР) глюкозою на продукцію позаклітинних ферментів пектатліаз у ptsI-мутанта і бактерій дикого типу Pectobacterium chrysanthemi.

Хід роботи:

1. Визначення продукції ферментів і впливу на неї катаболітной репресії І. Для визначення протео-і целюлозолітичної активності використовують

наступні штами бактерій, які виросли на поверхні повноцінного агаризованого середовища:

Pectobacterium carotovora subsp. carotovora J289 - дикий тип; Pectobacterium chrysanthemi A350 - дикий тип; Pectobacterium carotovora subsp. atroseptica D3310 - гіперпродуцент екзоферментів.

1.Визначення целюлолітичної активності проводять на мінімальному глюкозо-сольовому середовищі, що містить 0,2% розчинної целюлози.

Досліджувані штами засівають за допомогою петлі і чашки інкубують протягом 48 год. при 28оС. Після зазначеного періоду, чашки заливають 0,1% розчином барвника Конго червоного (3-4 мл) і витримують 15 хв. Барвник зливають, а чашки промивають кілька разів 8% розчином NaCl. Наявність світлих не зафарбованих плям в місці росту бактерій і навколо них свідчить про продукцію клітинами позаклітинних целюлолітичних ферментів.

2.Визначення протеолітичної активності проводять на мінімальному глюкозо-сольовому середовищі, що містить в якості субстрату 1%

знежиреного молока. Досліджувані штами засівають з допомогою петлі «медальйонами» і чашки інкубують протягом 48 год. при 28оС. Відзначають наявність зон освітлення навколо нанесеної суспензії мікроорганізмів, які свідчать про продукування бактеріями протеолітичних ферментів.

II. Для визначення впливу катаболітної репресії (КР) глюкозою на продукцію пектатліаз використовують штами бактерій, які виросли на поверхні повноцінного агаризованого середовища:

Pectobacterium chrysanthemi ENA49 - дикий тип бактерій, чутливий до КР;

Pectobacterium chrysanthemi ENA49/50 - ptsl-мутант бактерій, стійкий до КР;

166

РОЗДІЛ 8. ОСОБЛИВОСТІ БІОСИНТЕТИЧНОЇ АКТИВНОСТІ ПРОДУЦЕНТІВ ПЕРВИННИХ ТА ВТОРИННИХ МЕТАБОЛІТІВ

Pectobacterium chrysanthemi ENA49/50 (R'pts/) - ptsl-мутант, що має у складі плазміди pULB113 ptsf -ген E. coli.

3.Пектатліазна активність визначається на середовищі, яке містить поліпектатний гель. Він готується таким чином: 3 мл 1% розчину поліпектата натрію нашаровують на поверхню повноцінного агаризованого середовища, що містить іони Ca (3 мл 1М розчину СaCl2 на

100мл середовища). Досліджувані штами засівають за допомогою петлі «медальйонами» і чашки інкубують протягом 48 год. при 28оС. Штами бактерій, які продукують пектолітичні ферменти, утворюють лунки на поверхні поліпектатного гелю.

4.Для визначення впливу катаболітной репресії на продукування позаклітинних пектатліаз ті ж штами бактерій Pectobacterium chrysanthemi вирощують на середовищі для визначення пектолітичної активності з підвищеною кількістю (1%) глюкози.

5.Здатність штамів Pectobacterium chrysanthemi утилізувати глюкозу визначається на середовищі ЕМВ (що включає барвники еозин і метиленовий синій), до якого входить повноцінне агаризоване середовище, глюкоза і барвники. Досліджувані штами засівають за допомогою петлі

«медальйонами» на поверхню середовища і чашки інкубують протягом 48 год. при 28оС. Штами бактерій, які утилізують глюкозу набувають темносинього (металевого) коліру, що не утилізують глюкозу - рожевого кольору.

2. Облік результатів.

Для цього чашки переглядають і відзначають:

1.Наявність целюлолітичної активності у штамів бактерій роду Pectobacterium за появою зон освітління на середовищі з розчинною целюлозою після фарбування Конго червоним.

2.Наявність протеолітичної активності у штамів бактерій роду Pectobacterium за появою зон освітління навколо штамів після їх вирощування на середовищі зі знежиреним молоком.

Отримані результати заносять в табл.21.

Таблиця 21

Активність ферментів штамів бактерій роду Pectobacterium

Pectobacterium carotovora subsp. atroseptica 3-2

Pectobacterium carotovora subsp. carotovora J289

Pectobacterium chrysanthemi A350

Pectobacterium carotovora subsp. atroseptica

D3310

Примітка. Ступінь вираженості ферментативної активності умовно визначають в балах

(від «0» до «5»).

167

РОЗДІЛ 8. ОСОБЛИВОСТІ БІОСИНТЕТИЧНОЇ АКТИВНОСТІ ПРОДУЦЕНТІВ ПЕРВИННИХ ТА ВТОРИННИХ МЕТАБОЛІТІВ

3.Наявність пектолітичної активності у штамів Pectobacterium chrysanthemi по появі лунок розрідження поліпектатного гелю навколо засіяних колоній.

4.Вплив катаболітичної репресії глюкозою на продукцію пектатліаз у штамів Pectobacterium chrysanthemi з появою лунок розрідження поліпектатного гелю навколо засіяних колоній.

5.Здатність утилізувати глюкозу у штамів Pectobacterium chrysanthemi з фарбування колоній.

Отримані результати заносять в табл. 22.

Pectobacterium chrysanthemi ENA49

Pectobacterium chrysanthemi ENA49/50

Pectobacterium chrysanthemi ENA49/50 (Rpts/+)

Контрольні питання:

1.Обґрунтуйте механізми регуляції роботи індуцибельних і репресибельних оперонів, негативного і позитивного контролю діяльності оперонів на прикладі лактозного і триптофанового оперонів Escherichia coli.

2.Опишіть явище катаболітной репресії, діауксії, роль білків у транскрипції індуцибельних оперонів.

3.Запропонуйте способи підвищення продукції амінокислот або ферментів на рівні оперона.

Робота № 36. Визначення рівнів продукції β-каротину клітинами

Pantoea agglomerans

Оскільки каротиноїди є ліпідами, вони розчиняються в органічних розчинниках і можуть бути екстраговані з природних об'єктів полярними розчинниками, такими як ацетон, хлороформ і спирти.

На підставі цього виділення β-каротину з досліджуваних клітин здійснюється наступним чином.

Хід роботи:

1.Штами Pantoea agglomerans засівають петлею в рідке повноцінне середовище (10 мл) і вирощують в умовах аерації протягом 24 год.

168

РОЗДІЛ 8. ОСОБЛИВОСТІ БІОСИНТЕТИЧНОЇ АКТИВНОСТІ ПРОДУЦЕНТІВ ПЕРВИННИХ ТА ВТОРИННИХ МЕТАБОЛІТІВ

при 28°С (у середовище для плазмідовмісного штаму додають

Ap50Cm125);

2.5 мл культури бактерій центрифугують 5 хв. при 7000 об/хв. і відмивають фізіологічним розчином (5 мл);

3.Осад клітин ресуспендують в 2,5 мл діетилового спирту і залишають при мінус 20°С на 20 хв.;

4.Центрифугують протягом 10 хв. при 12000 об/хв., супернатант переносять в чисту пробірку.

5.Далі вимірюють оптичну щільність (ОЩ) супернатанта при 460 нм (пік поглинання β-каротину). Оскільки досліджувані бактеріальні культури можуть відрізнятися за швидкістю росту і, відповідно, за кількістю клітин, що продукують каротиноїди, вимірюють ОЩ вихідних бактеріальних культур при 600 нм.

6.Розрахунок кількості (С) β-каротину (в умовних одиницях) проводять за формулою:

Порівнюють кількість β-каротину, продукованого бактеріями Pantoea agglomerans.

Контрольні питання:

1.Охарактеризуйте принципи підбору біотехнологічних об’єктів.

2.Охарактеризуйте способи поліпшення продуцентів.

3.Наведіть приклади мікробіологічного виробництва лікарських засобів.

Робота № 37. Іммобілізація клітин Pseudomonas fluorescence у гелі альгінату кальцію. Визначення ефективності роботи каталази, оксидази і нітратредуктази у іммобілізованих клітин

Ефективність ферментативних процесів, які використовуються в самих різних областях людської діяльності, вдалося збільшити за допомогою іммобілізації ферментів. Іммобілізовані ферменти знаходять кілька переваг над своїми розчинними аналогами:

1)вони можуть бути відокремлені від продукту і використані повторно, що знижує вартість процесу;

2)іммобілізовані ферменти часто виявляють підвищену стабільність

ітривало зберігають активність;

3)вони придатні для безперервних процесів, які, в свою чергу, полегшують контроль за якістю і знижують вартість праці;

4)час реакції може бути зменшено за рахунок створення більш високого співвідношення ферментів і субстратів;

5)можна створювати мультиферментні системи.

169

РОЗДІЛ 8. ОСОБЛИВОСТІ БІОСИНТЕТИЧНОЇ АКТИВНОСТІ ПРОДУЦЕНТІВ ПЕРВИННИХ ТА ВТОРИННИХ МЕТАБОЛІТІВ

Однак застосування ферментів обмежено через їх низьку стабільність, здатність каталізувати тільки одну реакцію, високу вартість чистих препаратів. Крім того, для практичних цілей можуть використовуватися тільки ті ферменти, для яких не потрібна регенерація кофакторів. Тому в даний час поряд з іммобілізацією ферментів увагу дослідників все більше привертає іммобілізація клітин і органел. Клітини на відміну від ферментів представляють собою готовий біотехнологічний реактор, в якому реалізуються не тільки процеси, що призводять до утворення кінцевого продукту, але і багато інших, які сприяють підтримці каталітичної ефективності системи на високому рівні (наприклад, регенерація кофакторів). Оскільки ферменти функціонують у нативному оточенні, їх денатурація в процесі роботи зводиться до мінімуму. Це розширює число застосовуваних ферментів і дозволяє здійснювати як процеси синтезу, так і процеси деградації. Іммобілізовані клітини ідеально підходять для використання в реакторах з перемішуванням, через які пропускають субстрат. Перевагою таких реакторів є можливість їх багаторазового використання та отримання продукту, вільного від ферментів.

Звичайно, використання іммобілізованих клітин не позбавлено недоліків. Наприклад, клітинна стінка або плазматична мембрана можуть перешкоджати проникненню субстрату до ферменту або дифузії продукту з клітини. Крім того, виникає необхідність підтримки цілісності клітин і утримання їх у тій фазі росту, в якій синтезуються бажані ферменти. Нарешті, за великого числа присутніх у клітині ферментів (що в ряді випадків розглядається як перевага) можливий перебіг небажаних побічних реакцій.

Для іммобілізації клітин використовується безліч способів (сорбція інертними і іонообмінними носіями, ковалентне зв'язування з полімерним носієм, включення в гель) і носіїв різних типів (природні і синтетичні полімери й неорганічні речовини). Включення живих клітин вимагає м'яких умов іммобілізації, носій при цьому повинен являти собою систему відкритих пор з добрими умовами для газообміну. Слід брати до уваги і можливий шкідливий вплив на життєздатність клітин зшиваючих агентів. Найбільшого поширення набуло включення клітин в поліакріламідний гель і гель альгінату кальцію.

Альгінат - основний структурний полісахарид бурих морських водоростей. У присутності моновалентних катіонів полісахарид утворює в'язкий розчин, тоді як у присутності двовалентних катіонів, особливо кальцію, спостерігається утворення гелю. Оскільки гель утворюється в м'яких умовах, в ньому можна іммобілізувати живі клітини.

Мета роботи: Здійснити іммобілізацію клітин Pseudomonas fluorescens в гель альгінату кальцію. Визначити ефективність роботи каталази, оксидази і нітратредуктази у іммобілізованих клітин.

170