21
Из гипериммунной сыворотки в физрастворе готовят последовательные разведения 1:50, 1:100, 1:200, 1:400. Затем в каждую пробирку с указанными разведениями добавляют по две капли исследуемого антигена.
Контролями реакции служат: нормальная сыворотка кролика в разведениях 1:50, 1:100, 1:200, 1:400 со стандартным антигеном, физраствор со стандартным антигеном; физраствор с исследуемым антигеном; гипериммунная кроличья сыворотка в разведении 1:100 со стандартным антигеном.
После разлива компонентов пробирки тщательно встряхивают, помещают в термостат при 35 °С на 2 ч и проводят предварительный учет реакции. После этого пробирки оставляют при комнатной температуре на 18—20 ч и определяют окончательные результаты реакций.
Реакцию учитывают в крестах:
++++полная агглютинация, при которой осадок на дне пробирки располагается кучкой или в форме открытого перевернутого зонтика; надосадочная жидкость совершенно прозрачная;
+++почти полная агглютинация; осадок такой же, как и в предыдущем случае; жидкость почти прозрачная;
++слабая агглютинация; небольшой осадок, жидкость не прозрач-
ная;
+ отмечаются следы агглютинации, осадок едва заметен, жидкость не прозрачная;
- отрицательная реакция агглютинации. Бактерии могут оседать на дно в виде точки, при встряхивании разбиваются в равномерную муть. Положительной реакцией считают наличие микроскопической агглютинации с оценкой не менее чем в три креста в разведениях гипериммунной сыворотки 1:100 и выше и отсутствие агглютинации в контролях.
САЛЬМОНЕЛЛЕЗ. Для лабораторного исследования посылают живых больных пчел, а также соскобы фекалий с ульев или сотов. При микроскопическом и бактериологическом исследовании трупы пчел опускают в спирт, быстро обжигают для удаления микрофлоры с поверхностных покровов, складывают в стерильную ступку, добавляют физраствор, растирают и делают посевы на МПА и МПБ. Для получения чистой культуры посевы про-
22
изводят из гемолимфы и грудных мышц. Гемолимфу получают путем отделения одной из ножек или при помощи тонкой пастеровской пипетки, которую вводят в боковую сторону брюшка.
Возбудители сальмонеллеза в организме пчел могут приобрести изменчивость, которая выражается тем, что на плотных средах формируются колонии, несвойственные для этих видов бактерий (шероховатые с пальцеобразными выростами и др.). Изменяются и биохимические свойства. Они теряют способность ферментировать маннит, мальтозу или оба углевода одновременно. В то же время бактерии могут приобрести новое свойство — расщеплять сахарозу. Эта способность особенно выражена у Sal. cholere suis. Изменчивость также касается и антигенного строения микроорганизмов, что проявляется либо снижением агглютинационного титра, либо полной потерей способности вступать во взаимодействие с гомологичной для исходной культуры антисывороткой.
Патогенные свойства возбудителей сальмонеллеза пчел изучают на пчелах, которых помещают в специальный энтомологический садок, в потолочное отверстие которого вставляют пробирку вверх дном с бактериальной культурой, смешанной с густым сахарным сиропом (1:3), предварительно обвязанную двумя слоями марли. На 10 мл сиропа добавляют 0,1 мл 18—24- часовой культуры, содержащей 1 млрд. микробных тел. В контрольном опыте пчел кормят сахарным сиропом без микробной культуры. В положительном случае через 1—3 дня начинается массовая гибель пчел, в то время как в контроле погибают только единичные насекомые.
КОЛИБАКТЕРИОЗ. В лабораторию посылают живых больных пчел. При бактериологическом диагнозе обязательно выделяют чистую культуру возбудителя, изучают его культурально-морфологические и биохимические свойства, определяют 0-анти-ген, а при необходимости ставят биологическую пробу на пчелах.
От каждой пробы берут по 10 пчел и стерилизуют их поверхность ватным тампоном, смоченным спиртом. Затем с помощью тонкооттянутой пастеровской пипетки берут гемолимфу, переносят ее на поверхность подсушенного агара Эндо и растирают шпателем, затем проводят посев в МПБ. Посевы выдерживают сутки в термостате при температуре 32 °С. Одновре-
23
менно от тех же пчел готовят на предметных стеклах мазки, которые фиксируют раствором спирт-эфира (1:1) и окрашивают один мазок фуксином или метиленовой синью, а другой — по Граму. Мазки просматривают с использованием иммерсионной системы микроскопа через 18—24 ч инкубирования. В тех случаях, когда на -среде Эндо роста нет, а в МПБ отмечается помутнение среды, культуру микроскопируют и пересевают в чашку со средой Эндо;
через сутки проверяют наличие роста колоний. Э. коли на среде Эндо образует округлые выпуклые колонии с ровным краем розового, красного или малинового цвета с металлическим блеском. Для дальнейшего исследования переносят на скошенный МПА по Две произвольно взятых колонии или по две колонии каждой разновидности в случае получения неоднородного роста (каждую в 2 пробирки). Одну пробирку используют для изготовления мазков, посева на дифференциально-диагностические среды и приготовления убитого кипячением антигена, вторую — для получения автоклавированного антигена.
Проводят титрование выделенных бактерий по 0-антигену с целью установления энзоотических серотипов при помощи набора типоспецифических агглютинирующих сывороток. Если культура Е. coli серологически не типируется набором 0-сыворо-ток, используют другие диагностические сыворотки.
В том случае, когда из гемолимфы выделены бактерии Э. коли, которые не типируются серологически набором типоспецифических колисывороток, необходимо определить патогенные свойства кишечной палочки путем постановки биологической пробы на пчелах. С этой целью используют 2 садка с пчелами (по 100 штук в каждом). Пчел первого садка (контрольный) кормят сахарным сиропом (1:1), пчел второго садка (опытный) —сахарным сиропом с культурой Э. коли (1 млрд. клеток в 1 мл). Пчел в садках содержат 10 дней при температуре 30 °С, ежедневно подсчитывая погибших насекомых. Культуру признают патогенной, если наблюдаются признаки болезни у опытных пчел (вздутие брюшка, пятна экскрементов на стенке садка) и продолжительность жизни у них сокращается более чем в 2 раза по сравнению с продолжительностью жизни контрольных пчел.
24
Положительный диагноз на колибактериоз устанавливают при выделении из гемолимфы пчел культуры Е. coli и если она серологически типируется набором типоспецифических колисывороток или не типируется, но вызывает гибель пчел.
Определяют чувствительность выделенных патогенных кишечных палочек к антибиотикам и химиотерапевтическим препаратам, руководствуясь методикой, описанной ниже, для всех возбудителей.
АСКОСФЕРОЗ. Для микроскопического исследования используют соскоб с поверхности тела пораженных личинок. Небольшое количество полученного материала помещают на предметное стекло в каплю 50 %-ного водного раствора глицерина или лактофенола (20 г кристаллического фенола, 16 мл молочной кислоты и 31 мл глицерина) и рассматривают при малом увеличении микроскопа с целью обнаружения мицелия и плодовых тел гриба.
Для подтверждения результатов микроскопического исследования из патматериала выделяют чистую культуру гриба. Для этого трупы личинок извлекают из ячеек, помещают в стерильную пробирку с 2 мл физраствора, вносят туда же 1000 ЕД пенициллина и 1000 ЕД стрептомицина, тщательно растирают и материал высевают на скошенный сусло-агар или среду Сабуро в пробирках. Посевы культивируют в течение 10 сут при температуре 28—32 °С. На 3—5 сут на поверхности среды появляются белые пушистые колонии, дающие к 8—10 сут зеленовато-серый налет на дне и по краям колонии, который образуется при формировании плодовых тел гриба. Колонии могут остаться белыми в том случае, если в пробирке будет развиваться мицелий лишь одного пола. Чистую культуру гриба получают путем пересева с периферии колоний, характерных для данного гриба.
Мицелий гриба состоит из многоклеточных гиф толщиной 4,2—12 мкм с многоядерными клетками, обладает половым диморфизмом. Женский мицелий — белый, мужской — желтовато-зеленоватый, в результате сложного полового процесса образуются многочисленные одноклеточные споры диаметром 1,9— 3,2 мкм, склеенные в шары. Плодовые тела диаметром 27—77 мкм покрыты толстой оболочкой.
25
АСПЕРГИЛЛЕЗ. В лабораторию посылают трупы пчел (не менее 50) и соты с погибшими личинками (ЗХ 15 см). Материал посылают в стерильных банках с притертыми пробками.
При микроскопическом исследовании пчел и личинок помещают в чашки Петри и просматривают под малым увеличением для обнаружения на поверхности их тела характерного спороно-шения гриба (конидиальные головки). Затем готовят препараты для изучения гриба при большом увеличении. Делают соскобы с поверхности погибших пчел и личинок, а также сотов и помещают их на предметное стекло в каплю из смеси спирта, воды и глицерина (равные части), покрывают покровным стеклом и исследуют на наличие гриба.
Для выделения культуры возбудителя кусочки трупов, а также кишечника помещают в чашку Петри на агар Чапека. Для предупреждения бактериального роста к среде добавляют антибиотики (пенициллин — 50 ЕД/мл, стрептомицин — 100 ЕД/мл). Культивируют при температуре 25—30 °С. Через 3—4 дня появляются желто-зеленые колонии гриба Asper. flavus, они мелкозернистые с воздушным мицелием по краям. Мицелий белый или желтый с отходящими от него многочисленными конидиеносцами размером 400—1000Х 5—15 мкм, на конце которых имеются округлые вздутия 10—40 мкм в диаметре. На вздутиях образуются отходящие радиально одноярусные или двухъярусные стеригмы с расположенными в виде цепочек конидиями размером 3—6 мкм в диаметре.
В посевах из патматериала могут выделяться также Asper. fumigatus с темно-зелеными колониями, Asper. niger с черно-коричневыми колониями и другие грибы.
МЕЛАНОЗ. В ветеринарную лабораторию направляют трупы маток в 50 %-ном растворе глицерина. Присланных пчел обрабатывают йодированным спиртом. Затем с соблюдением стерильности проводят вскрытие (обнаруживают почернение яичников и других внутренних органов) и готовят из пораженных органов суспензию на стерильном физрастворе и препараты для микроскопии. С этой целью на предметное стекло наносят каплю лактофенола (20 г кристаллического фенола, 16 мл молочной кислоты, 31 мл чистого глицерина), в нее вносят небольшой кусочек пораженного органа и расщеп-