6
Отправляемый патматериал сопровождают письмом ветеринарного специалиста, производившего отбор и упаковку проб. В нем указывают наименование хозяйства (фамилию, имя, отчество владельца пасеки), адрес, номер улья, количество проб, характерные признаки заболевания и цель исследования. При подозрении на отравление прилагают акт или копию акта комиссии, обследовавшей пасеку и отобравшей материал, в сопроводительном письме конкретно указывают, на какой ядохимикат следует провести исследование. Сопроводительное письмо должно иметь штамп ветеринарного учреждения.
Срок доставки проб на исследование в лабораторию не должен превышать 1 суток с момента отбора материала.
Ветеринарная лаборатория регистрирует поступивший материал в соответствующем журнале, а результаты исследований сообщает в хозяйство. При установлении возбудителя болезни определяют чувствительность выделенного микроорганизма к антибиотикам и рекомендуют применение наиболее активного антибиотика. После исследования патматериал сжигают.
Тема 2 (4часа)
ПОРЯДОК ИССЛЕДОВАНИЯ ПАТМАТЕРИАЛА.
Каждый образец патматериала обрабатывают по следующей схеме:
а) наружный (визуальный) осмотр сотов и подмора пчел; б) осмотр и отбор больных личинок и пчел под лупой; в) вскрытие личинок и взрослых пчел; г) микроскопия нативных мазков; д) посевы на питательные среды; е) изучение культурально-биохимических свойств; ж) в сомнительных случаях изучают серологические и патогенные свойства некоторых изолированных культур.
Результаты исследований регистрируют в специальном журнале.
АМЕРИКАНСКИЙ ГНИЛЕЦ. Диагноз на американский гнилец ставят на основании характерных признаков поражения расплода и результатов микроскопических, бактериологических и серологических исследований. Предварительно заключение дают в первый день исследования на основании осмотра сота и обнаружения характерных спор Вас. larvae в мазках из патма-
7
териала. Окончательный диагноз ставят на 3—5 день исследования после получения чистой культуры Вас. larvae.
Для микроскопии готовят тонкие мазки из гнильцовой массы или «корочек» (2—3 штуки), которые предварительно размачивают теплым (35—40 °С) стерильным физраствором в течение 20—30 мин. Его наливают в ячейки, тщательно перемешивают гнильцовую массу вращательными движениями конца пастеровской пипетки. При плохом размачивании в прокрашенных кусочках тканей споры обнаружить трудно. В тягучей гнилостной массе и корочках обнаруживают споры возбудителя, которые хорошо окрашиваются 2 %-ным спиртовым раствором карболового фуксина в течение 1,5—2 мин (по Граму споры не окрашиваются). На искусственных питательных средах спорообразование слабое или отсутствует. Споры овальной формы (1,2—1,8Х
0,6— 0,7 мкм).
При микроскопии мазков (увеличение 900) обнаруживают грамположительные палочки Вас. larvae длиной 1,5—6 мкм и шириной 0,5—0,8 мкм; они располагаются цепочками в виде стрептобацилл.
Для выращивания возбудителя американского гнильца пчел используют следующие среды.
1. Среда Томашеца (или мясо-пептонный сывороточный агар): ее готовят добавлением к расплавленному и охлажденному до 45—50 °С мясопептонному агару (рн 6,8—7,0) 10 % стерильной лошадиной сыворотки. Агар-агар используют только растительный (нельзя брать для этой цели агар с рыбьим гидролизатом, так как на нем Вас. larvae не растет).
2. Мясо-пептонный сывороточный бульон: к обычному (лучше приготовленному из отвара конского мяса) мясо-пептонному бульону (рН 6,8— 7,2) добавляют 10 % стерильной лошадиной сыворотки.
3. Яичный агар и бульон Уайта: свежее яйцо протирают ватным тампоном, смоченным этиловым спиртом, и обжигают на огне, затем стерильно вскрывают; отделяют белок, желток выливают в колбочку с 70 мл стерильной воды и тщательно смешивают. К 5 мл расплавленного и охлажденного (45—50 °С) МПА, или МПБ, в пробирке добавляют стерильно по 1 мл эмульсии желтка и круговыми движениями пробирки между ладонями рук тщательно смешивают агар или бульон с желтком. Перед посевом среды выдерживают двое суток в термостате для определения стерильности.
8
4.Кровяной агар Цейслера: 3 %-ный мясо-пептонный агар (рН 7,2— 7,4), приготовленный из растительного агар-агара, разливают в колбы по 100 мл и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 120 °С; по мере необходимости агар в колбе расплавляют в водяной бане, а затем охлаждают до 42—45 °С. К агару добавляют 10 мл 20 %-ного стерильного раствора глюкозы и 15— 20 мл стерильной свежевзятой или дефибринированной крови овцы (лучше лошади). Смесь осторожно перемешивают (избегать образования пены!) и разливают в стерильные чашки. Для подсушивания среды чашки выдерживают
втермостате 4—6 ч. Дефибринированную кровь можно заготавливать впрок (на 10—15 дней), сохраняя еѐ в стерильных условиях по 20—25 мл в колбочках.
5.Кровяная среда Тошкова: к обычному или содержащему желточную эмульсию мясо-пептонному агару или бульону добавляют стерильно 5—10 % дефибринированной крови лошади или овцы.
6.Среда Майкла: дрожжевой экстракт — 10 см3, пептон — 10 г, растительный агар-агар — 15 г, тиамин — 0,1 мг, дистиллированная вода — 1 л, рН — 6,8. Экстракт дрожжей готовят из 100 г измельченных хлебных дрожжей в 1 л водопроводной воды, смесь тщательно перемешивают и кипятят 30 мин, затем отстаивают, фильтруют в горячем состоянии через 3 слоя марли и оставляют до просветления. Экстракт в этот же день употребляют для приготовления среды или добавляют к нему 1 % хлороформа, что позволяет сохранять его в холодильнике до месяца.
Получить чистую культуру Вас. larvae на плотной питательной среде из отдельных клеток возбудителя трудно. Поэтому на поверхность плотной питательной среды необходимо вносить как можно больше гнильцовой массы.
Видимый рост отдельных колоний Вас. larvae на среде Томашеца появляется и заметен невооруженным глазом через 24 ч в виде типичных шероховатых (тип R) колоний размером 1—3 мм в диаметре; они нежные, слегка выпуклые, вначале прозрачные, затем серо-белые. Колонии имеют характерные, отходящие в стороны, отростки в виде «усиков». При сплошном росте на поверхности агара (через 48—72 ч с момента посева) появляются серова- то-белые наложения, имеющие ограниченные локоно-образные края. На мя- со-пептонном сывороточном бульоне они образуют через 24 ч помутнение.
9
Через 48—74 ч на дне пробирки заметен хлопьевидный осадок в виде ваты, легко разбивающийся при встряхивании в равномерную муть.
Наряду с типичными R-формами колоний встречаются и диссоциированные от действия бактериофага и других факторов атипичные RSформы (переходные) с гладкими краями, с единичными нитевидными отростками или колонии S-формы круглые, выпуклые, с ровными краями и гладкой поверхностью.
При просмотре мазков из атипичных колоний палочки Вас. larvae бывают короткими и толстыми, они утрачивают способность располагаться цепочками, иногда встречаются уродливые формы палочек — извитые, вздутые и др.
Биохимические свойства выделенных штаммов Вас. larvae изучают путем выращивания на обычных питательных средах пестрого ряда, к которым добавляют 10 % стерильной лошадиной сыворотки. Все типичные штаммы Вас. larvae медленно (6—10 дней) расщепляют глюкозу и левулезу с образованием кислоты, но без газа, не сбраживают арабинозу, ксилозу, лактозу, рамнозу, мальтозу, сахарозу, галактозу, маннит, дульцит, сорбит, инозит. Не образуют индола, аммиака, сероводорода (отдельные штаммы слабо выделяют сероводород и аммиак). Разжижают желатину, вызывают свертывание и пептонизацию молока, не гидролизуют крахмал, нитраты восстанавливают, не обладают гемолитическими свойствами, каталазный тест — отрицательный.
Серологическую диагностику проводят с помощью реакции преципитации, используя ларвейную преципити-рующую сыворотку или реакцию капельной агглютинации.
Антиген для реакции преципитации готовят из десяти погибших от гнильца личинок, которых помещают в ступку, добавляя десятикратное количество физраствора (15 мл для взрослых и 7 мл для 3—4-дневных личинок), тщательно растирают, суспензию нагревают на кипящей водяной бане 15 мин и фильтруют через асбестовую вату до получения прозрачного экстракта. Антигеном для реакции преципитации может служить и прозрачный фильтрат выросшей культуры, профильтрованной через асбестовую вату. Фильтрат разливают по 0,1—0,2 мл в уленгутовские пробирки и подслаивают такое же количество сыворотки (сыворотки и фильтраты должны быть
10
прозрачными). Реакция преципитации протекает при комнатной температуре в течение 15 мин. При положительной реакции через 0,5—2 мин образуется тонкое, нежное, голубовато-матовое кольцо.
Антигены для реакции агглютинации готовят из 5— 10 свежих трупов личинок или «корочек», которые помещают в фарфоровую ступку и заливают 5—10 мл карболизированного 0,5 %-ного физраствора, измельчают пестиком до получения суспензии и фильтруют через ватный фильтр. Фильтрат центрифугируют 10—15 мин при 1500 об/мин, затем осадок растворяют в 10—15 мл указанного выше физраствора, нагревают на водяной бане до 70 °С и в горячем виде фильтруют через бумажный фильтр. Фильтрат вновь центрифугируют при тех же оборотах, и из осадка готовят антиген в виде густой взвеси микробов и спор (10 млрд/мл).
Реакцию агглютинации ставят на предметном стекле: на один его конец пастеровской пипеткой наносят каплю агглютинирующей сыворотки, разведенной физраствором (0,1 мл сыворотки + 7,9 мл физраствора), а на другой конец — каплю физраствора. В обе капли вносят такое же количество антигена и хорошо смешивают. При положительном результате в течение 10—20 мин в капле с ларвейной сывороткой жидкость просветляется и наблюдается мелкозернистая агглютинация (появляются белые крупинки). В контрольной капле жидкость остается мутной. Агглютинация в капле с ларвейной сывороткой свидетельствует об американском гнильце.
Фагодиагностику осуществляют с применением ларвейного бактериофага. На поверхность чашки Петри с мясопептонным сывороточным агаром шпателем засевают две капли суточной бульонной культуры и наносят в центр каплю бактериофага. Чашку наклоняют для стока бактериофага, а затем переворачивают ее кверху дном и ставят в термостат на 24—48 ч. В положительном случае на месте протекания капли фага образуется полоса, свободная от роста микробов.
Патогенные свойства устанавливают при заражении пчелиного расплода или кроликов. В стерильные бактериологические чашки, на дне которых уложен слой ваты, покрытой двумя слоями стерильной марли, вносят по 10 мл теплого корма: приготовленного из перги — 50 г, пекарских дрожжей — 5 г, воды водопроводной — 100 мл. Смесь нагревают в водяной бане 45 мин при температуре 100 °С и после охлаждения добавляют равный объем не-