Материал: 1795

16

натной температуре. При положительной реакции на границе сыворотки и антигена в течение 10—20 мин появляется преципитационное кольцо в виде тонкого серо-белого диска. Положительная РП с плютоновой, альвейной или другими специфическими сыворотками свидетельствует о европейском гнильце. В контрольной пробирке с нормальной сывороткой реакция должна быть отрицательной. Реакцию капельной агглютинации ставят с соответствующими сыворотками, аналогично американскому гнильцу.

Лабораторные животные не восприимчивы к европейскому гнильцу. Патогенные свойства возбудителей этого вида гнильца могут быть установлены путем заражения 3—4-дневных личинок, как и при американском гнильце.

ПАРАГНИЛЕЦ. В лабораторию направляют кусочки сотов с пораженным расплодом и куколками. Микроскопические и бактериологические исследования проводят по общепринятым методикам, описанным выше.

Вас. paraalvei—палочка длиной 2,2—5,7 мкм, шириной 0,5—0,8 мкм. В погибших личинках и на питательных средах она образует слегка овальные споры 1,8—2,3 X 0,9— 1,3 мкм. В бульонных культурах подвижна — перитрих, факультативный аэроб, плохо растет на обыкновенных питательных средах (МПА и МПБ); хорошо культивируется на кровяном сахарном агаре Цейслера и среде Томашеца (10 %-ный сывороточный мясо-пептонный агар, рН 5,8—7,0 и мясо-пептонный сывороточный бульон) при температуре 34— 38,5 °С. На поверхности среды образуются шероховатые колонии с синеватым Металлическим оттенком, обладающие ползучим ростом. Спорообразование на среде Томашеца и агаре Цейслера плохое. Все штаммы Вас. paraalvei гидролизуют крахмал; образуют индол; восстанавливают нитриты; разжижают желатину; не ферментируют глюкозу, рафинозу, маннит, салицин, адонит; реакция Фогес — Проскауера отрицательная; зон гемолиза на кровяном агаре не дает, что отличает его от Вас. alvei.

Патогенные свойства возбудителя могут быть установлены - путем заражения открытого расплода по методике, описанной при американском гнильце.

17

ПОРОШКОВИДНЫЙ РАСПЛОД. Для лабораторного исследования в ветеринарную лабораторию посылают образцы сотов от каждой семьи размером 10Х 15 см с пораженными личинками.

Возбудитель—грамположительная палочка размером 1— 1,5 мкм в длину и 0,6—1,2 мкм в ширину, споры эллипсоидной формы (0,8—1,2Х 1,5 мкм), расположены центрально или терминально; факультативный анаэроб.

Для выделения возбудителя в 2—3 ячейки сота, содержащих остатки разложившихся личинок, вносят по одной капле стерильного физраствора. Бактериологической петлей переносят полученную взвесь на МПА в чашке Петри и равномерно распределяют шпателем по его поверхности. Затем посевы инкубируют при 37 °С. Одновременно из взвеси готовят мазки, фиксируют пламенем или раствором спирт-эфира (1:1), окрашивают по Граму и исследуют под микроскопом. Через 2—3 сут инкубирования посевы просматривают. На МПА возбудитель растет в виде колоний светло-оранжевого или светло-коричневого цвета, либо в виде тонкого буроватого налета.

Из каждой чашки по две типичные колонии переносят на скошенный мясо-пептонный агар для получения чистой культуры.

Для изучения морфологии выделенных чистых культур бактерий готовят мазки, фиксируют их, окрашивают по Граму и микроскопируют. Подвижность культур определяют по характеру роста в 0,3 %-ном полужидком МПА. Биохимические свойства культур исследуют на средах с сахарами, желатине, казеине, крахмало-аммиачном агаре, ставят пробу на каталазу. На средах с глюкозой, маннитом, трегалозой они образуют кислоту, разжижают желатину, разлагают казеин, не изменяют крахмал. Тест на каталазу отрицательный.

Лучшее спорообразование происходит в течение 5—7 дней инкубации на МПА с добавлением экстракта пыльцы.

Положительный бактериологический диагноз ставят при выделении культуры Вас. pulvi-faciens.

18

Рис. Pseudomonas apisepticum. Увеличение Х900.

СЕПТИЦЕМИЯ. В лабораторию посылают не менее 10 штук больных пчел. При невозможности доставить в лабораторию живых пчел делают маз- ки-отпечатки из грудных мышц.

Возбудитель — Pseudomo-nas apisepticum — полиморфная, грамотрицательная, подвижная, не образующая спор, палочка Длиной 0,8—2 мкм, шириной 0,7—0,8 мкм (рис. ); факультативный аэроб, хорошо растет на обычных питательных средах (рН 7,2—7,4); оптимум роста 20—37 °С.

При микроскопическом исследовании поверхность хитинового покрова груди пчел дезинфицируют обжиганием, прокалывают перепонку между сегментами тонкой пастеровской пипеткой и набирают гемолимфу, из которой затем готовят мазки и производят посевы на питательные среды (МПА, МПБ). Мазки фиксируют на пламени горелки и красят по Граму. В положительном случае в мазках обнаруживают однородные грамотрицательные палочки.

Pseud, apisepticum на агаре образует крупные, с ровными краями мут- но-опаловые в центре и светлые к периферии маслянистые, легко смывающиеся колонии. При сплошном росте на агаре культура приобретает мутнозеленоватый оттенок и гнилостный запах; на пластинчатой желатине образуются колонии с глубоким центром разжижения, при посеве уколом желатина воронкообразно разжижается по ходу укола и выделяются пузырьки газа; на агаре Эндо формируются красные колонии, цвет среды не изменяется.

После получения чистой культуры изучают ее биохимические свойства на наборе питательных сред (среды с углеводами, желатина, молоко, МПБ с индикаторными бумажками для исследования на индол и сероводород, ломтик картофеля). Учет проводят через 1—2 сут. На картофеле вырастают хо-

19

рошо заметные, выпуклые, маслянистые колонии, постепенно темнеющие от бурого до почти черного цвета; буреет и сам картофель.

Pseud, apisepticum свертывает и пептонизирует молоко; образует кислоту, затем щелочь; выделяет сероводород; разлагает без образования газа, но с накоплением щелочи фруктозу, галактозу, маннозу, сорбит, глицерин, салицин; образует небольшое количество кислоты в средах с рафинозой, арабинозой, крахмалом, лактозой, изодульцитом; декстрин не разлагает, нитраты восстанавливает до нитритов; индола не образует.

ГАФНИОЗ. В лабораторию посылают живых больных или мертвых пчел. В лаборатории выделяют чистую культуру возбудителя болезни или ставят реакцию агглютинации.

Возбудитель — Hafnia alvei. Это бактерия, имеющая вид палочки с закругленными концами, длина ее 1—2 мкм, ширина 0,3—0,5 мкм; подвижная (перитрих), грамотрицательная, хорошо красится всеми анилиновыми красителями. Факультативный аэроб. Спор не образует. При 20 °С она хорошо растет на обычных и элективных питательных средах, ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, с образованием кислоты — арабинозу, ксилозу, мальтозу, маннит, рамнозу; не дает реакции с метилротом; образует ацетилметилкарбинол, сероводород; утилизирует цитрат аммония; декарбоксилирует лизин и орнитин; не гидролизирует аргинин; не ферментирует адонит, дульцит, инозит, инулин, лактозу, рафинозу, салицин, сахарозу, сорбит и эритрит; не дезаминирует фенилаланин; не разлагает дезоксирибонуклеазу, мочевину, крахмал; не выделяет индол; не разжижает желатину; не изменяет молоко.

Для получения культуры от каждой пробы берут по 10 пчел, помещают их на 30 с в 96 %-ный спирт, затем обсушивают на стерильной фильтровальной бумаге и вскрывают. Для этого пчелу пинцетом фиксируют за грудку, стерильной препаровальной иглой удаляют спинное полукольцо со стороны заднего грудного тергита и из грудных мышц делают посев на среду Эндо. Одновременно из мышц готовят два мазка на предметных стеклах, окрашивают один метиленовой синькой, второй по Граму и просматривают с помощью иммерсионной системы микроскопа. Посевы выращивают при комнатной температуре (20 °С). На МПА бактерии гафнии растут в виде полупро-

20

зрачных, круглых, с ровными краями колоний, легко снимающихся петлей. Из колоний готовят мазки, красят по Граму, микроскопируют и сравнивают с микрофлорой мазков из грудных мышц. Грамотрицательные бактерии исследуют на подвижность. Подвижные грамотрицательные бактерии пересевают на МПА, а затем делают посевы на цветной ряд Гисса с глюкозой, лактозой, маннитом, сахарозой и сорбитом; на среду с цитратом аммония; в две пробирки со средой Кларка; в МПБ с индикаторными бумажками на индол и сероводород и на желатину. Посевы бактерий на среде с цитратом аммония и в одной пробирке со средой Кларка выращивают при комнатной температуре, остальные — при 35 °С. С культурами, выращенными на среде Кларка при 35 °С, ставят реакцию с метилротом, а при 20 ° С — реакцию Фогес — Проскауэр на ацетилметилкарбинол. Желатину охлаждают.

Срок бактериологического исследования на гафниоз пчел 4 дня. Серологическая диагностика гафниоза пчел основана на постановке

реакции агглютинации возбудителя со специфической сывороткой. Для постановки реакции агглютинации необходимы:

а) стандартная культура Hafnia alvei (стандартный антиген);

б) гипериммунная сыворотка; ее получают от кроликов, для этого животному вводят внутривенно выращенную на МПА суточную культуру возбудителя в концентрации 3—5 млрд. микробных тел в 1 мл 4 раза через 5 дней в следующих количествах:

При первой инъекции — 0,5 мл, второй — 1 мл, третьей — 1 мл, четвертой — 1,5 мл. Через 7—10 дней после четвертой инъекции у кролика берут кровь и получают сыворотку; ее можно использовать в течение 10 мес при условии хранения в холодильнике при температуре 4 °С;

в) нормальная сыворотка кролика; г) физраствор, содержащий 0,85 % химически чистого натрия хлорида

и 0,5 % карболовой кислоты; д) исследуемый антиген — смыв бактериальной культуры, содержа-

щий 3—5 млрд. микробных тел в 1 мл. Для этого берут 20 пчел с признаками заболевания и помещают на 2—3 мин в стакан с углекислым газом. Затем берут гемолимфу тонким капилляром, который вводят сбоку между 3 и 4 тергитами брюшка и высевают на МПА. Посевы выращивают в течение суток при 35 °С.