11
прогретого меда. Затем в здоровой пчелиной семье от сота с расплодом срезают острым, слегка подогретым ножом верхнюю часть ячеек и осторожно извлекают 3—4-дневных личинок, которые размещают в бактериологических чашках по 15—20 штук. Через сутки выдерживания в термостате при температуре 35 °С отбирают под контролем лупы здоровые (неповрежденные) личинки и переносят их в заранее подготовленную теплую чашку. Личинок заражают путем скармливания им свежего корма, к которому добавлено 2 млрд. исследуемых микроорганизмов. Ежедневно под лупой отбирают больных личинок и подвергают микроскопическому и бактериологическому исследованиям. Контролем служат незараженные личинки, содержащиеся в тех же условиях.
Для заражения расплода в микроулейках и ульях используют двухмиллиардную взвесь микробов в сахарном сиропе (1 часть воды+2 части сахара) ежедневно в течение 3—5 дней. Для получения инфицированного корма на 5 частей сиропа берут 1 часть культуры. Такой сироп дают 3— 5 дней. Суточное количество этой подкормки для пчел в микроулье — 50 мл, для пчел в стандартном улье — 500 мл. Признаки гнильца появляются через 8—10 дней после заражения. С 3— 5 дня до окончания биопробы пчелам в микроульях нужно давать сахарный сироп. Подкормку наливают в банки, обвязывают их двумя слоями марли и перевертывают вверх дном. В стандартных ульях банки ставят на рамки, в микроульях — в потолочное отверстие.
Для постановки биопробы на кроликах вначале готовят споровую взвесь Вас. larvae из первичного материала. Для получения спор используют пчелиные личинки, погибшие от американского гнильца и высохшие до состояния корочек. Последние извлекают из ячеек сотов стерильным пинцетом, помещают в стерильные фарфоровые ступки, растирают и добавляют стерильный физраствор (1 мл на 1 растертую корочку). Содержимое тщательно перемешивают. Полученную массу фильтруют через вату. Если фильтрат вязкий, к нему добавляют физраствор до исчезновения слизистой консистенции и снова фильтруют через фильтровальную бумагу. После двукратного центрифугирования фильтрата получают в осадке чистые споры Вас. larvae, отмытые от тканей личинки. Концентрацию спор в 1 мл определяют по оптическому стандарту мутности.
12
Заражают кроликов внутривенно споровой взвесью в дозе 5—6 млн. спор в 1 мл (по оптическому стандарту мутности) на одно животное, морских свинок подкожно дозой 3 млн. спор. Гибель кроликов наступает на 5—7 день, свинок—на 8—10-е сут. Из крови больных и из внутренних органов павших животных выделяют возбудителя американского гнильца пчел.
ЕВРОПЕЙСКИЙ ГНИЛЕЦ. Предварительное заключение о результатах исследования на европейский гнилец может быть дано в день поступления патматериала на основании осмотра сота и микроскопии мазков, окончательный — после проведения полного бактериологического исследования, т. е. через 5—7 дней при условии выделения возбудителя болезни.
Для лабораторного исследования из ячеек сотов извлекают стерильным пинцетом не менее 10 свежих трупов личинок, а при их отсутствии — высохшие корочки трупов. Мазки и посевы производят из содержимого кишечника личинки. Корочки трупов предварительно помещают на 15—20 мин в стерильный физраствор. Мазки окрашивают одновременно и по Граму, для окраски спор возбудителя используют 2 %-ный спиртовой раствор карболового фуксина в течение 1,5—2 мин.
При бактериологическом исследовании недавно погибших личинок чаще обнаруживают Streptococcus pluton, в мазках, приготовленных из загнившей массы личинок и их корочек, как правило, находят споры Вас. alvei, иногда Вас. orpheus, а в мазках из тела личинок с кислым запахом — Strept. apis.
Streptococcus pluton имеют форму вытянутых (ланцетовидных) кокков размером 0,5—1,5 мкм. В мазках они располагаются одиночно, чаще попарно, цепочками и в виде характерных скоплений «розетками»; в культуре и тканях образуют капсулу, окружающую несколько кокков, хорошо красящуюся по методу Кленбергера, Томчика и Новелли. Микроб неподвижен, спор не образует. Стрептококки красятся всеми анилиновыми красками и по Граму (неравномерно), иногда с грамположительными встречаются и грамотрицательные кокки.
Из патматериала стрептококк плютон выделяют культивированием посевов при 35 °С на средах Бейли или Черепова в анаэробных условиях, для
13
чего используют анаэростат или обычный эксикатор, который после постановок чашек или пробирок с посевами наполняют углекислотой (5—10% СОа). Последующее культивирование выделенных штаммов этого возбудителя можно производить и в аэробных условиях.
Для культивирования Strept. pluton используют:
1.Среду Бейли: дистиллированная вода—1 л, глюкоза, растворимый крахмал и экстракт дрожжей — по 10 г, калий фосфорнокислый однозамещенный (КНгРО^)—13,6 г, агар-агар растительный — 20 г (рН 6,6). Среду автоклавируют при 116 °С в течение трех дней подряд по 20 мин. Первичный рост возбудителя на этой среде появляется через 4—7 сут, при последующих пересевах — через 24—48 ч.
2.Среду В. Т. Черепова: в 1 л водопроводной воды вносят 300 г очищенных клубней картофеля (обязательно удалить глазки!), варят в течение 15—20 мин (не доводя до полного разваривания клубней), фильтруют через ватно-марлевый фильтр и к 1 л фильтрата добавляют 2 % растительного агар-агара, 3 г пептона. Смесь стерилизуют в автоклаве при 1 атм 20 мин, затем добавляют 3 % экстракта пекарских дрожжей и 3 % глюкозы, рН 6,8.
Стерилизуют в аппарате Коха 3 дня по 30 мин или в автоклаве при 0,5 атм 3 дня по 15 мин.
3.Для культивирования Strept. pluton можно использовать полужидкий 0,15%-ный картофельный агар, приготовленный аналогично среде Черепова,
стой лишь разницей, что вместо 2 % добавляют 0,15 % растительного агарагара.
На плотных средах Strept. pluton образует мелкие, круглые, выпуклые, зернистые жемчужно-белого цвета непрозрачные колонии диаметром 1—1,6 мм. В печеночном бульоне и полужидком агаре стрептококк растет с образованием помутнения и нежного пристеночного кольца, на дне пробирки через двое суток выпадает белый осадок. Strept. pluton расщепляет глюкозу и фруктозу без образования газа, не расщепляет сахарозу, галактозу, лактозу, малтозу, рафинозу, рамнозу, маннит, сорбит, инозит, а-ксилозу, глицерин и крахмал. Strept. apis располагается в мазках короткими цепочками, размер отдельных кокков 0,7—0,9 мкм, грамположительная, спор не образует, капсулы не имеет; факультативный аэроб, хорошо растет при температуре 37 °С на обычных средах, а также на средах Бейли, Черепова, кровяном агаре
14
Цейслера. Через 24 ч на агаре образуются мелкие, прозрачные, бесцветные колонии или наложения, они легко снимаются петлей и суспензируются в физрастворе. Микроб вызывает помутнение бульона, разжижает МПЖ, молоко свертывает и пептонизирует, индол и сероводород не образует, выделяет следы аммиака, углеводы разлагает с образованием кислоты, крахмал не гидролизует, нитриты не восстанавливает, на кровяном агаре не вызывает гемолиза.
Вас. alvei—спорообразующая палочка длиной 3—4,5, шириной 0,7— 0,9 мкм; по Граму красится положительно, подвижна, перитрих. Споры располагаются центрально, 2,5— 4 мкм в длину и 0,8—1,5 мкм в ширину, иногда образуют ряды в виде частокола. Возбудитель—факультативный аэроб, растет при температуре 37 °С на обычном МПА и МПБ, кровяном агаре Цейслера, через сутки образуя на агаре крупные колонии неправильной формы в виде «оленьих рогов» грязно-желтого цвета. На агаре Цейслера он образует гемолиз типа р, иногда а. Бульон мутнеет равномерно, на 3—5 день на его поверхности образуется бесцветная или сероватая гладкая, нежная не стабильная пленка со слабым пристеночным кольцом. При встряхивании она опадает хлопьями на дно пробирки. Вас. alvei медленно разжижают МПЖ, молоко свертывают и пептони-зируют, образуют индол; обнаруживаются следы аммиака и сероводорода; крахмал не гидролизируют, нитриты не восстанавливают, расщепляют глюкозу, мальтозу, глицерин, лактозу, сахарозу с образованием кислоты, но без газа. Биохимические свойства не постоянны. Старые культуры имеют неприятный запах, особенно сильный при культивировании микроба на кровяном агаре.
Вас. orpheus — спорообразующая подвижная с закругленными концами палочка длиной 2,5—5 мкм и шириной 1—1,2 мкм. Микроб окрашивается всеми анилиновыми красками и грамполо-жительно. Споры хорошо окрашиваются 2 %-ным спиртовым раствором фуксина в течение 2 мин. В мазках вегетативные и споровые формы микроба располагаются поодиночке. Споры овальной формы длиной 1,2—2 мкм и шириной 0,7—1,2 мкм, располагаются сбоку в средней раздутой части бациллы, характерно также наличие с одной стороны споры арфоили лодкообразного параспорального тела. Бацилла орфеус-аэроб, растет на обычных питательных средах (МПА и МПБ) и особенно хорошо на печеночном агаре с нейтральной или слабоще-
15
лочной реакцией при температуре 35—36 °С. Для приготовления печеночного агар-агара берут свежую печень крупного рогатого скота или свиней, разрезают на куски массой 200—250 г, заливают равным количеством водопроводной воды и автоклавируют при 120 °С в течение часа, затем экстракт фильтруют через ватный фильтр. Параллельно готовят смесь: 2 г растительного агар-агара, 1 г пептона, 0,5 г натрия хлорида и 500 мл водопроводной воды, которую стерилизуют текучим паром 30 мин. Затем к печеночному экстракту добавляют равное количество указанной смеси и после охлаждения до 60 °С устанавливают рН 7,0—7,2. После этого печеночный агар-агар разливают по пробиркам или колбам, стерилизуют автоклавированием при 120 °С в течение 30 мин.
На плотной среде колонии появляются через 24 ч после посева, они 2— 3 мм в диаметре, с ровными краями, беловато-серого цвета с голубоватым оттенком и металлическим блеском, к 48 часам образуется пышное сероватобелое наложение. МПБ в начале мутнеет, затем на дне образуется осадок и бульон просветляется. Желатину разжижает медленно, молоко коагулирует с образованием плотного сгустка. Микроб ферментирует глюкозу, мальтозу, маннозу, декстрозу, ксилозу, салицин и маннит с образованием кислоты, но без газа и не ферментирует сахарозу, рамнозу, лактозу, галактозу, арабинозу, дульцит, сорбит, инозит и адонит. Индола и сероводорода не образует, реакция с метилрот отрицательная, реакция Фогес — Проскауэр положительная, нитраты восстанавливает, на кровяном агаре образует гемолиз типа ос.
При проведении серологической диагностики ставят реакцию преципитации (РП). Антигены для этой реакции готовят из 5—10 трупов пораженных личинок, которые отбирают из присланных образцов сотов. Личинок растирают в фарфоровых ступках с 5 мл физраствора, затем переносят в пробирки и нагревают на кипящей водяной бане в течение 15 мин. Экстракт фильтруют через асбестовую вату (в воронках диаметром 4 см). Прозрачный фильтрат разливают по 0,1—0,2 мл в чистые уленгутовские пробирки и подслаивают такое же количество сыворотки: в первую пробирку — преципитирующую плютоновую, во вторую — преципитирующую альвейную и т. д., в последнюю — нормальную сыворотку лошади (для контроля). Сыворотки так же, как и экстракты, должны быть прозрачными. Мутные сыворотки предварительно фильтруют через асбестовую вату. РП проходит при ком-