3. Хирургические и молекулярные исследования свиного GALT
.1 Гомологии IPP овец и свиней
Фиг.2А показывает распределение основных лимфоидных тканей, связанных с желудочно-кишечным трактом свиней. Так как овцы -жвачные животные, их желудочно-кишечный тракт сильно отличается, от животных с однокамерным желудком, но, тем не менее, делятся с свиньей непрерывным IPP на терминальном конце подвздошной кишки. Возможно, это особенность всех парнокопытных, но широко распространенные данные не доступны. Как обсуждалось ниже, IPP развивается в течение внутриутробной жизни у обоих видов, содержат около 90% В-клеток, и инволюции в послеродовом периоде. По этой причине и поскольку оба парнокопытные, мы рассмотрим IPP как гомологичные структуры у овец и свиней.
.2 Поросенок-модель для исследований ИПП
Решении вопросов, касающийся млекопитающего эквивалента к куриной бурсе требует использования управляемой системы при переходе от плода к постнатальной жизни, что может контролировать влияние различных факторов внешней среды после родов. У поросят и ягнят, нет никакой передачи трансплацентарных иммуноглобулинов и других белков [53, 54]. Кроме того, потомство выводковое и, следовательно, может быть воспитано отдельно от своих биологических матерей.
Весь помет поросят может быть восстановлен кесаревом и выращенные в изолирующих единицах или в специфических патоген-свободных свиноматках(?). В этой среде, большинство экологических воздействий можно управлять с помощью экспериментатора [55, 56]. Этот процесс является гораздо более громоздким с ягнятами, в связи с их размерами и их пищевой зависимости как жвачных животных и, как обычно есть только 1-3 потомства, что не делает их адекватной экспериментальной группы.
Учитывая общность ИПП, модель поросенка более эффективно и было использовано в ряде лабораторий, в то время как аналогичное использование ягнят редко. Поросята, восстановленные кесаревом могут поддерживаться 5-8 недель в изоляторах;длина зависит от того, используются ли обычные европейские свиньи, или используются поросят [56, 57]. Так как свиньи жвачные, их послеродовые требования просты, и они могут быть выращены на формулах человеческих младенцев. Хирургия может быть сделано как на плоду так и на новорожденных поросятах с использованием изоляторов, предназначенных изначально для недоношенных детей [58]; это может быть жестко с ягненками. Хирургические исследования неинфицированных ягнят не сообщались.Полезной особенностью модели поросят является «дружественное использование " тяжелой и легкой цепи преиммунного репертуара. Свинья использует семь VH генов, два разнообразия генов тяжелых цепей и один соединяющий ген тяжелыми цепи для генерации 95% от их преиммунного репертуара [59, 60]. Это упрощает процесс мониторинга диверсификации репертуара тяжелой цепи репертуаре на плода и новорожденного жизни, в результате развития RDI, что: (1) рассматривает изменения в относительной использование VH генов и (2) степень SHM [61, 62]. Мониторинг репертуара легкой цепи также упрощается, так как два Vк гена и один Jк составляют 80% от к репертуара, и ген счет три V???? и один J???? для более 70% от ???? репертуара [28, 63] , В сочетании с исследованиями на одной совместной окружности, сайты-клеток лимфогенезиса могут быть определены [64]. В целом, поросенок, возможно, обеспечивает гораздо более управляемую модель для решения вопросов, касающихся иммунитетного онтогенеза, в том числе роли ИПП, у кроликов и овец.
В-клетки не специализироваться в ИПП плода и неинфицированных поросят
ИПП характеризуются преобладанием В-клеток у всех видов, которые обладают IPP, таких как овцы [10, 65], свиньи [18, 66, 67], телят [68], коз [69], и олень [70]. Тем не менее, это доминирование В-клеток в IPP основан на данных из обычных животных (взрослого типа распределения лимфоцитов), и это отличается от распределения лимфоцитов во время внутриутробной жизни (плода типа распределения лимфоцитов), где также есть другие виды лимфоцитов [10, 66].Плодный тип распределения лимфоцитов может быть четко продлен в стерильных животных, которые не имеют доступа к колонизации бактерий [67]. Анализ новорожденных свиней показывает, что каждый фолликул содержит ИПП 1-3 длину CDR3, предполагая, что каждый фолликул питает олигоклональное или моноклональное население В-клеток (фиг. 2С).Линейный анализ EAGE показали, что В-клетки, экспрессирующие определенный ген VH, например, VHB (IGHV12), пролиферируют с помощью нескольких поколений, в течение которых ген разнообразит от SHM [55, 57]. Это и те открытия , суммированы на фиг. Aпоказать низкую частоту SHM (????10 мутации / Kb) у плода поросят [28, 59 - 62], который продолжается в той же скоростью поддерживается у неинфицированных порося в течение 5 недель [59].Спектратипичный профиль для IgM и IgA у плодного IPP появляется отобранный и Gaussian, тогда как для IgG3 показывает некоторые выборы клонов . Это согласуется с ограниченной степенью диверсификации репертуара (низких значений RDI) у плода и у стерильных поросят по сравнению с коллективно-изолированными поросятами, подвергшихся воздействию окружающей среды антигена (рис. 3В). Эти результаты показывают, что в фетальных или стерильных поросят, нет никаких доказательств того, репертуар диверсификации антиген-независимой или SHM, как сообщалось для ягнят Рейном и его коллегами [13, 14].
3.3 Адаптивные реакции в IPP требующий окружающий антиген
Плодный тип распределения лимфоцитов в ИПП найден в эмбриональных и стерильных поросятах преобразуется в шаблон характеристикой адаптивного иммунитета после колонизации, т.е. взрослых тип распределения лимфоцитов [67] (рис. 4). Колонизация с доброкачественной E.coli, может привести к этому, но изменение является более выраженным с помощью смеси 10 синантропных бактериальных штаммов или полностью сформированной сложной колонизации [67] (рис. 4, а).Переход от плода к адаптивного типа распределения лимфоцитов следующей колонизации указывает, что события в IPP являются адаптивными и происходят антиген-зависимым способом. Это видно и по изменению в распределении изотипа ; В-клетки плода и / или новорожденного IPP являются более 90% IgM+;Небольшое количество IgG транскрибируется в более чем 50%, состоит из IgG3 (фиг. 5А). После колонизации, IgA и IgG популяции расширяется (рис. 5B), а транскрипция IgG3 падает с более 50% до 5% [17, 28] (рис. 5А).Увеличение IgA+ коммутируемым В-клеток [67] также сопровождается увеличением доли активированного и эффекторной стадии лимфоциты, такие как CD2????CD21???? В-клеток [71] (рис. 4б), CD2????CD8???? ???????? Т-клеток [72-75], и CD4????CD8???? ???????? Т-клеток [37, 38] (рис. 4C). Все эти изменения характерны для вторичных лимфоидных тканей. В соответствии с этой тенденцией является приближенным увеличение в десять раз диверсификации репертуара антител в ИПП и в другой лимфоидной ткани (фиг. 3B), а частота увеличивается СТМ три-пять раз ниже колонизации (рис. 3А).Увеличение в репертуаре диверсификация (рис. 3В) проходит параллельно спектратипичному шаблон, который показывает клонов выбор в инфицированных вирусом поросят [76].
Определение первичных В-клеток лимфоидной ткани, как уже говорилось выше, предполагает, что удаление такой ткани должны привести к: (1) недостатку В-клеток и Ig, (2) неспособности поддерживать уровень В-клеток, и (3) подавление антителному репертуару развития. Рис.6 показывает, что резекция ИПП не влияют на кинетику падения периферических В-клеток, частоту лимфоцитов в лимфоидной ткани различной (рис. 7), или фенотипу В-клеток [67]. Кроме того, частота IgM-, IgG-и IgA-содержащих В-клеток в MLNs не была затронута, за исключением того, что IgG+ В-клетки была чаще у поросят с удаленной IPP [77]. Это согласуется с увеличением сывороточного IgG, которые мы считаем результатом воспалительной реакции после хирургического манипуляции [77]. Резекция не изменяет уровни Ig в BAL, слюне, и в промывание кишечника [77]. Таким образом, IPP свиней не являются существенным источником В-клеток и не требуются для поддержания В-клеток, системном уровнях Ig, или на слизистой сайтов. Кроме того, удаление не мешает репертуару диверсификации антител в MLNs, TBLNs и селезенке (рис. 8). IPP также не сайт-клетоклимфогенеза, поскольку население B клеточной линии в IPP не похоже на развивающихся клеточных линейных В клеток в костном мозгу [67], и сигнал совместного круга отсутствует [64, 77]. С другой стороны, костным мозгом было показано, что они в полной мере способны на лимфогенез В-клеток и остается активным по крайней мере, за тот же период времени, какой предположили для IPP [39, 64, 78-80].
3.5 В-клеточные подмножества и альтернативных места развития В-клеток
Обсуждение первичной В-клеточной лимфоидной ткани и бурсальных эквивалентов должны также рассмотреть подмножество многообразия. У мышей, людей и нескольких других видов,признаются две субпопуляции В-клеток. У мышей, В-1 клетки экспрессируют высокие уровни CD5, тогда как B-2 или так называемые обычные В-клетки или CD5???? CD5lo [81].В-1 подмножество также характеризуются как имеющие ограниченный и недиферсифицированный репертуар и производят с низким сродством, полиреактивного IgM [82]. Кроме того, В-1 клетки это IgD???? / IgDlo. Большинство считают, что B-1 и B-2 клетки возникают из отдельных линий; В-1 клетки возникают из брюшины, в то время как В-2 клетки возникают из костного мозга [83]. У мышей, В-1 клетки преобладают в брюшной полости, но содержат менее 5% от селезенки и крови В-клеток [84]. У людей, до 30% В-клеток в крови или периферийных лимфоузлов являются CD5hi. В видах GalT , таких как кролики и куры, почти все клетки B являются CD5hi; то есть, теоретически, все они B-1 клетки [85, 86]. У свиней и жвачных животных, количество В-клеток CD5hi аналогична, что и у людей [87]. Но, у крупного рогатого скота, похоже, не выражены IgD, но у генома кроликов и кур не хватает IgD [32, 88, 89]. Лимфогенез В-1 клеток является определяющим; т.е. уровни В-клеток поддерживаются митотической пролиферации, в отличие от обычных В-клеток, которые производятся непрерывно в течение всей жизни Костного мозга [90]. Интересно, что В-клетки лимфогенеза у кроличьего костного мозга ослабевает в течение нескольких месяцев [91], и аналогичное убывание происходит у свиней, так как измеряется по исчезновению сигнала совместных кругах [64]. Лимфогенез В-клеток у кур также определен [92].
Эти корреляционные замечания, касающиеся В-клеток подмножества среди различных видов GalTа может привести одно положение, что нижняя часть кишки GALT является первичной лимфоидной тканью для B-1 клеток и что после резекции GALT , самообновление характерное для B-1 клеток позволяет восстановить уровни В-клеток . Возможно, это объясняет, почему после нижней части кишечника GALT резекции, В-клеток и уровни Ig остались без изменения, или незначительно ниже [29, 30, 35, 40, 67, 77]. В оригинальных исследованиях Купера и др. [31] и его повтора 30 лет спустя [40], оба следственные группы считали, что непринятие мер по ликвидации отсека B клеток был полностью результатом клеток, которые пошли непосредственно на костный мозг и другие периферические лимфоидные ткани, где они распространились и заселили хозяина , Они могут также включать в себя долгоживущие клетки плазмы, описанные Ахмедом и коллегами [93]. Другое объяснение состоит в том, что остатки GALT могут выжить, восстановить, и компенсировать его снятие, в качестве замены В-клеток у детей после удаления костного мозга может произойти через 3-6 недель [94]. У поросят удаленной IPP, замена не объяснить отсутствие влияния на Ig и B уровнях клеток, так как нет никаких доказательств того, что начальное истощение сопровождается отскоком(рис. 6) [66, 76], как показано на кролики [40].
Определение того, какие подмножества восстанавливает уровни В-клеток после резекция сопряжено с трудностями. Во-первых, CD5 не может быть надежным показателем B-1 клеток, а некоторые цитокины могут регулировать до CD5 выражение обычных В-клеток [95]. У свиней, выражение CD5 не коррелирует с различием между B-1 и B 2-клеток в зависимости от степени диверсификации репертуара [96]. Однако этот вывод является ошибочным, так как разница в Vн использования один малый параметр для диверсификации репертуара свиней, потому что Vн использование не изменится, даже в сильно антигенизных животных [62, 97]. Скорее, степень диверсификации репертуара отражается на частоте SHM, так же, как у кролика [40].
Определение того, какие подмножества восстанавливает уровни В-клеток после резекция сопряжено с трудностями. Во-первых, CD5 не может быть надежным показателем B-1 клеток, а некоторые цитокины могут регулировать до CD5 выражение обычных В-клеток [95]. У свиней, выражение CD5 не коррелирует с различием между B-1 и B 2-клеток в зависимости от степени диверсификации репертуара [96]. Однако этот вывод является ошибочным, так как разница в Vн использования один малый параметр для диверсификации репертуара свиней, потому что Vн использование не изменится, даже в сильно антигенизных животных [62, 97]. Скорее, степень диверсификации репертуара отражается на частоте SHM, так же, как у кролика [40].
За исключением плода бурсэктомии кур, полное разрушение В-клеток и Ig может быть достигнуто только путем рентгеновского излучения [31]. В дополнение к пополнению самообновляющихся B-1 клеток или В-клеток, происходящих из остаточных тканей, существуют и другие альтернативы. Лимфожелезный комплексы (или ректальные миндалины) находятся по всему объему свиной толстой кишки (рис. 2) и подобные структуры встречаются и у других млекопитающих, включая человека [98], грызунов, других жвачных животных [99], и морских млекопитающих [100]. Есть также микроскопические фолликулы в подвздошной кишке, что не удалены в GALT-неимеющих кроликах [40]. Если все эти структуры являются важной частью GALT, то полное удаление желудочно-кишечного тракта могло бы быть единственным средством для определения того, является ли вся конгломератом бурса млекопитающих. В любом случае, появление В-клеток и их дальнейшей экспансии в толстом лимфожелезном комплексе сильно зависит от колонизации кишечника и / или возникновения патогенных микроорганизмов [99].
Выводы
Млекопитающий бурситный эквивалент не дискретный орган или не существует.
Когда первичные лимфоидные ткани определяется как сайт лимфогенеза В клеток, ни птичья бурса ни GALT млекопитающих не квалифицируется как первичная лимфоидная ткань. Тем не менее, кандидатуры для первичной В-клеток лимфоидной ткани также включает (1)развитие (техническое обслуживание) нормальных уровней В-клеток, (2) репертуар диверсификации, и (3) независимость антигена. При использовании этих дополнительных критериев, только сумки Фабрициуса проходят тест в качестве системно- первичной клеточной В лимфоидной ткани. В то время как высокий уровень пролиферации и апоптоза в IPP овец [21, 22] и свиней [23] внешне наводит на мысль о лимфогенеза, мы не обнаружили сигнала совместного круга в IPP, в то время как они были в изобилии в костном мозгу [62, 64 ]. Это наблюдение напоминает что куриная Бурса с резидентными В-клетками являются иммигрантами. Однако, апоптотических и митотические ставки в IPP были сопоставимы с селезенкой [67], вторичной лимфоидной тканью. Рейном с соавторами [13, 14] были представлены доказательства для энергичных репертуарных изменений и их антигенов независимости в исследованиях на IPP у новорожденных овцах. Трудность этого исследования является то, что степень SHM не была сравнена с другими лимфоидными тканями, в то же время или даже признание того, что определенный уровень SHM является онтогенетическим, не антиген-принесенным [28, 61-63]. Наши данные для поросят показывают, что скоростьSHM(рис. 3) или степень диверсификации репертуара (рис. 8) не уникальная особенностью IPP, и они похожи во всех плодах и / или стерильных тканях. Диверсификация репертуара в кроличьем аппендиксе происходит путемSHM и генной конверсии [32], но она также встречается в селезенке, рассматривается большинством как вторичная лимфоидная ткань. В IPP свиней [17, 76] (рис. 3) и аппендиксе кролика [101], диверсификация репертуара в значительной степени антиген-зависимая. Таким образом, энергичная клеточная активность в IPP, кажется, связанного с выбором, класс переключателя, и фенотипа изменения, подобно тому, как происходит во время зародышевых реакций. Хирургическая резекция кроличбего GALTа не устранит все В-клетки или сыворотки Ig, но ухудшает иммунологическое реагирование и диверсификацию репертуара [31]. Как послеродовой бурсэктомия не исключает полного отсека куриных В клеток , можно утверждать, что неэффективность удаления GALTа у кролика может быть результатом времени. Чтобы проверить эту гипотезу, удаление GALTа должно быть сделано в эмбриональной жизни, но может быть в настоящее время это невозможно. Тем не менее, маловероятно, что у плода резекция IPP поросят изменило бы исход экспериментов, которые мы описали, как нет повышенным уровнем диверсификации репертуар и нет доказательств В-клеток лимфогенеза в ИФП плода поросят. По крайней мере, у кроликов, после рентгеновского облучения, а не просто удаление кролика GALT, необходимость произвести дефицит В-клеток так же, как у мышей [31]. Таким образом, простая экстраполяция функции из куриного бурсы в GALT млекопитающих не поддерживается эмпирически, как удаление крупных структур нижнего GalT не системно удалять В клеточные вставки и различные клеочные активности не уникальны для этих структур