Материал: Вопросы к Экзамену 305

19. Получение ферментных препаратов с помощью микроорганизмов. Номенклатура микробных ферментных препаратов.

По экономическим и технологическим соображениям получать ферменты с помощью микроорганизмов более выгодно, чем из растительных и животных источников. В специально созданных условиях микроорганизмы способны синтезировать огромное количество разнообразных ферментов. Они неприхотливы к составу питательной среды, легко переключаются с синтеза одного фермента на другой и имеют сравнительно короткий цикл роста (16-100 часов). Продуцентами ферментов могут быть различные микроорганизмы: бактерии, грибы, дрожжи, актиномицеты. Для промышленного получения ферментных препаратов используют как природные штаммы микроорганизмов, так и мутантные штаммы. Микроорганизмы могут синтезировать одновременно целый комплекс ферментов, но есть и такие, особенно среди мутантных штаммов, которые являются моноферментными и образуют в больших количествах только один фермент. Микробные клетки содержат или продуцируют более двух тысяч ферментов, катализирующих биохимические реакции, связанные с ростом, дыханием и образованием продуктов. Многие из этих ферментов могут быть легко выделены и проявляют свою активность независимо от того, находятся ли они внутри клетки или в культуральной жидкости.

Производство ферментных препаратов осуществляется и поверхностным, и глубинным способами. При поверхностном способе в качестве продуцентов используются грибы. Питательные среды при этом способе имеют твердую или рыхлую консистенцию. Основой почти всех сред являются увлажненные пшеничные отруби. Для придания среде рыхлой структуры и ее обогащения к пшеничным отрубям добавляются древесные опилки или солодовые ростки. Культивирование проводят в условиях аэрации.

Глубинный способ выращивания принципиальных отличий от поверхностного не имеет. Культивирование проводят в жидких средах, а продуцентами могут быть и бактерии.

Номенклатура ферментных препаратов микробного происхождения

Существует определенная система названия ферментных препаратов, в которой учитываются: основной фермент, источник получения и степень очистки. Подавляющее количество ферментных препаратов является комплексным, содержащим помимо основного фермента еще значительное количество сопутствующих ферментов и белков. Поэтому в технологии ферментов препараты чаще классифицируют по основному компоненту в смеси ферментов, присутствующих в данном препарате: амилолитические, протеолитические, липолитические и т.д.

Наименование каждого препарата включает сокращенное название основного фермента, затем добавляется видовое название продуцента, заканчивается название препарата суффиксом "ин". Например, амилолитические препараты, получаемые из культур Aspergillus oryzae и Bacillus subtilis, называются соответственно амил-ориз-ин (амилоризин) и амил-о-субтил-ин (амилосубтилин). Мальтаваморин П2х (продуцент A. awamori содержит в основном мальтазу). Целловиридин Г3х (продуцент Trichoderma viride содержит в основном целлюлолитические ферменты).

Далее ставится индекс, в котором обозначены способ производства и степень очистки фермента от балластных веществ. При глубинном способе культивирования после названия ставится буква Г, а при поверхностном - П. После букв Г или П может стоять цифра, обозначающая степень чистоты препарата. Индекс 2х обозначает жидкий неочищенный концентрат исходной культуры; 3х - сухой ферментный препарат, полученный высушиванием распылением неочищенного раствора фермента (экстракта из поверхностной культуры или культуральной жидкости). Технические ферментные препараты с индексами 2х и 3х чаще используются в легкой промышленности и сельском хозяйстве. Для пищевой промышленности, медицины и научных исследований требуются очищенные и высокоочищенные ферментные препараты. Индекс 10х означает сухие препараты, полученные осаждением ферментов органическими растворителями или методом высаливания; цифрами 15х, 18х, 20х обозначают препараты, частично освобожденные не только от балластных веществ, но и от сопутствующих ферментов; выше 20х - высокоочищенные и даже гомогенные ферментные препараты.

В нашей стране выпускаются следующие ферментные препараты: амилосубтилин и протосубтилин (продуцент - Bacillus subtilis), пектофоетидин (Aspergillus foetidus), мальтаваморин (Aspergillus awamori), амилоризин (Aspergillus oryzae), глюконигрин (Aspergillus niger) и другие.

20. Применение ферментных препаратов в пищевой промышленности.

Протеолитические ферменты продуцируются грибами рода Aspergillus, Penicillium, бактериями рода Bacillus, дрожжами рода Saccharomyces. Эти ферменты используют при переработке животного сырья в мясной, молочной и рыбной промышленности. Они применяются как размягчители мяса, ускорители созревания мяса и рыбы. При проведении слабого протеолиза с использованием набора специфических ферментов происходит незначительное изменение структуры мяса, но оно становится качественно лучше, значительно мягче. Особенно важным является действие ферментов на белки соединительной ткани

Ввиду нехватки сырья для получения сычужного фермента в последние годы ведутся интенсивные работы по поиску его заменителей ферментами микробного происхождения для сыродельной промышленности.

В пивоваренном производстве протеолитические ферменты применяют для устранения белковых помутнений, а в хлебопечении - для сокращения времени замеса теста из пшеничной муки с высоким содержанием клейковины. Протеолитические ферменты используют как добавки к моющим средствам, что дает высокий эффект при устранении белковых загрязнений.

Амилолитические ферменты продуцируют грибы рода Aspergillus, Penicillium, Mucor и бактерии рода Bacillus. Самыми большими потребителями являются спиртовая и пивоваренная промышленности. Амилазы микробного происхождения добавляют при подготовке пивного сусла, при спиртовом брожении, чтобы перевести крахмал в форму, усваиваемую дрожжами. Тем самым можно ускорить или полностью заменить солодование зерна в пивоварении. Кроме того, амилолитические ферменты применяют в хлебобулочном производстве, способствуя улучшению структуры мякиша хлеба.

Целлюлолитические ферменты, участвующие в гидролизе целлюлозы, представляют собой комплекс, состоящий из нескольких ферментов с различной специфичностью действия: эндоглюканазы, экзоглюкозидазы, β-глюкозидазы и др. применяют в спиртовой, пищеконцентратной промышленностях, где сырьем являются растительные материалы или отходы переработки растений, например, в производстве растворимого кофе.

Пектолитические ферменты продуцируют грибы родов Aspergillus (Aspergillus niger), Penicillium, бактерии Erwinia caratovora, Clostridium sp. Пектиназы представляют комплекс ферментов, состоящий из полигалактуроназы, пектинметилэстеразы и др. Эти ферменты используют при производстве осветленных соков из плодов и ягод, для осветления вин.

В производстве кисло-молочных продуктов используется реннин - ферментный препарат, осуществляющий свертывание молока. Получают его с помощью микроорганизмов Endothia parasitica и Mucor sp.

Наибольшее распространение получили препараты, в которых ферменты в активной форме прикреплены к нерастворимой основе. Такие ферментные препараты называют иммобилизованными. Преимуществом их применения является возможность многократного использования. В этом случае обрабатываемый раствор пропускают через основу с иммобилизованным ферментом.

21. Получение биомассы микроорганизмов в качестве источника белка.

Получение биомассы микроорганизмов в качестве источника белка

Сбалансировать содержание в кормах белка и его аминокислотный состав можно с помощью биомассы микроорганизмов.

Этот белковый источник имеет ряд преимуществ:

• большая скорость роста микроорганизмов (микроорганизмы растут в 500 раз быстрее, чем сельскохозяйственные культуры и в 1000-5000 раз быстрее, чем самые быстрорастущие породы животных);

• высокое содержание белка в биомассе: дрожжи способны накапливать до 40-50 % белка от своей массы, а некоторые бактерии до 60-70 % белка;

• удовлетворительная биологическая ценность белков: по содержанию большинства незаменимых аминокислот (лизина, триптофана и др.) белок многих дрожжей и бактерий соответствует эталону (яичному белку);

• независимость производства от погодных и сезонных условий: биомассу микроорганизмов можно получать круглогодично;

• возможность выращивания биомассы на различных непищевых субстратах и на отходах ряда производств;

• возможность организации производства микробного белка индустриальными методами с применением автоматизации.

Использование того или иного продуцента при производстве белковых препаратов определяется составом питательной среды и назначением белка. Требования менее строги, если белок предназначен для кормовых целей и должны быть высокими, если белковые препараты используются в пищу.

Эффективность применения микроорганизма-продуцента для производственных целей определяется, с одной стороны, скоростью его роста, с другой - степенью использования питательных веществ среды. Продуценты белков должны отвечать следующим требованиям:

• накапливать 40-70 % белка от своей биомассы;

• максимально усваивать питательные вещества среды;

• не являться болезнетворными и не выделять в среду токсических продуктов;

• обладать высокой устойчивостью и выживаемостью в нестерильных условиях выращивания;

• иметь высокую скорость размножения и роста;

• легко отделяться от среды.

Промышленные культуры, используемые для биосинтеза белковых веществ, должны отвечать медико-биологическим требованиям.

Преимуществом дрожжей перед другими микроорганизмами является их технологичность: устойчивость к инфекциям, легкость отделения от среды благодаря крупным размерам клеток по сравнению с бактериями, способность усваивать различные источники углерода, азота и способность расти на простых средах, высокие питательные свойства и приятный запах биомассы.

Преимуществом бактерий является высокая скорость роста, бόльшее, чем у других микроорганизмов, содержание белка и незаменимаой аминокислоты метионина в биомассе. По составу аминокислот бактериальный белок приближается к животному и поэтому имеет бόльшую ценность в качестве кормового препарата.

Кроме того, биомасса дрожжей и бактерий имеет высокое содержание нуклеиновых кислот (до 12 % и до 16 % соответственно), что ведет к образованию нежелательных продуктов распада в животном организме.

Водоросли, как и все другие микроорганизмы, водоросли являются перспективным источником получения белка. Они легко отделяются от субстрата, медленнее растут, чем дрожжи и поэтому содержат меньше нуклеиновых кислот в биомассе.

Грибы. Для получения кормового и пищевого белка можно использовать промышленное выращивание различных видов низших и высших грибов.

22. Производство хлебопекарных дрожжей и их экспертиза.

Дрожжи – постоянный спутник человека, они используются в разных микробиологических процессах. Хлебопекарные дрожжи в России начали выращивать в монастырях еще 14-15 вв. Прессованные дрожжи начали производить в 1972 г. в Германии.

Биомассу дрожжей, как источник пищевого белка, человек применяет только в экстремальных условиях (во время голода или в качестве компонента сухого пайка для альпинистов, мореплавателей). Одной из причин малой популярности дрожжевых блюд является сравнительно толстая клеточная оболочка дрожжей, которая затрудняет их усвоение организмом.

Наши представления о питательной ценности дрожжей постепенно меняются. Человек хорошо овладел искусством выращивания дрожжей в промышленных условиях, биотехнологи освоили технологию выращивания богатой белками биомассы хлебопекарных дрожжей Saccharomyces cerevisiae на простых синтетических средах (например, на этиловом спирте микробного или химического происхождения), а химики разработали способы выделения из дрожжевой биомассы очищенных белковых концентратов. Хлебопекарные дрожжи могут метаболизировать этиловый спирт благодаря наличию в клетках алкогольдегидрогеназы, но рост дрожжей на этаноле имеет множество особенностей

Промышленное производство хлебопекарных дрожжей

Обычно для промышленного производства дрожжей используют питательную среду, основным компонентом которой является меласса – отход сахарного производства (свекловичная или из сахарного тростника). Дрожжи выращивают в биореакторах (ферментерах) периодического действия аэробным глубинным способом при рН 4,4-4,5 по так называемому приточному методу. В чистый аппарат вводят 70-80 % теплой воды от необходимого конечного разведения мелассы (1 : 17 – 1 : 30, в зависимости от первоначальной концентрации сахаров), добавляют 10 % мелассы и растворы солей, устанавливают оптимальные рН среды и температуру и начинают умеренную аэрацию (1 об/ (об · мин)). В такую среду вносят посевной материал. В течение 1-го часа среду не добавляют, а в последующие 10 ч ее вводят непрерывным потоком в количествах 5; 6; 7,2; 8,2; 9,2; 10,2; 12,8; 11,0 и 9 % в час от общего количества питательной среды. Аэрация в течение всего процесса ферментации также меняется. В первый и последний час культивирования она меньше (1 : 1), а в период интенсивного размножения дрожжей достигает 1,5 – 2,0 об / (об · мин). В таких условиях дрожжи проходят все стадии развития. В стационарной фазе роста культуру выдерживают до полного прекращения интенсивного почкования.

Во время ферментации незначительно возрастает концентрация среды (от 0,9 до 2,2 по сахариметру) и титруемая кислотность (от 0,3 до 0,8 мл 1 н раствора кислоты на 100 мл среды). В таких условиях выход прессованных дрожжей составляет 150 % от количества использованного сахара (или 37,5 % сухой биомассы).

После ферментации дрожжи отделяют от среды путем центрифугирования или фильтрации на фильтр-прессе, затем биомассу тщательно промывают водой. Товарные дрожжи могут быть сухими и прессованными.

Прессованные дрожжи хранят при пониженной температуре (4-6 ^оС), так как при комнатной температуре бактерии и микромицеты быстро повреждают дрожжевые клетки

Экспертиза хлебопекарных дрожжей

При экспертизе товарных дрожжей определяют: органолептические показатели (внешний вид, цвет, запах и вкус, консистенцию); влажность дрожжей (для прессованных дрожжей, согласно ГОСТ 171-81, массовая доля влаги не должна превышать 75 %); содержание мертвых клеток (не более 5 %); способность дрожжей к размножению (доля почкующихся клеток должна составлять 40-70 % от общего количества); биологическую чистоту (годными для производства считаются дрожжи, содержащие не более 1 % бактерий и не более 0,5 % диких дрожжей); подъемную силу. Подъемная сила дрожжей характеризуется временем, прошедшим с момента внесения теста в форму до подъема теста до 70 мм. Подъемная сила дрожжей должна быть не более 70 мин.

Хлебопекарные дрожжи широко используются в различных отраслях пищевой промышленности: хлебопекарной, пивоваренной, при получении этилового спирта, вин и т.д.