Материал: Вопросы к Экзамену 305

11. Особенности стадии выделения и очистки в зависимости от целевого продукта. Продукты микробного брожения и метаболизма.

     Стадия  выделения продукта существенно  зависит от того, накапливается продукт  в клетках или он выделяется в  культуральную жидкость, или же продуктом является сама клеточная масса. Разделение биомассы и культуральной жидкости - сепарация - осуществляется несколькими методами. Если целевым продуктом является биомасса клеток, применяют следующие методы выделения: отстаивание, фильтрация, флотирование, сепарирование и т.д. (механические способы); выпаривание и сушка (физические способы).

     К физическим методам можно отнести разрушение клеток под действие ультразвука, замораживания-оттаивания, баллистическую дезинтеграцию. Баллистическая дезинтеграция клеток осуществляется в мельницах, куда помещают суспензию клеток и вспомогательные мелющие вещества: песок, стеклянные или полимерные шарики.

     К химическим методам дезинтеграции относят разрушение клеток с помощью толуола, бутанола и других химических соединений.

     При использовании ферментативной дезинтеграции клеток используют ферменты, способные разрушать определенные структурные компоненты клеточных стенок микроорганизмов

12. Направленный синтез лимонной кислоты.

Синтез лимонной кислоты связан с циклом дикарбоновых кислот и происходит в результате конденсации какой-либо кислоты, содержащей четыре атома углерода и две карбоксильные группы, с кислотой, имеющей два атома углерода и одну карбоксильную группу. Химизм образования лимонной кислоты представлен на рис. 4.1. В результате гликолиза глюкозы образуется пировиноградная кислота. На следующем этапе происходит ферментативное связывание пировиноградной кислоты с диоксидом углерода. Образовавшаяся щавелевоуксусная кислота вступает далее в реакцию с уксусной кислотой и образуется лимонная кислота. Таким образом, химизм образования лимонной кислоты включает реакции гликолиза и ряд реакций, замкнутых в цикл Кребса. При каждом обороте этого цикла молекула щавелевоуксусной кислоты вступает во взаимодействие с молекулой уксусной кислоты, образуя лимонную кислоту.

13. Получение молочной кислоты биотехнологическим способом.

Молочная кислота (СН3СНОНСООН) – органическая одноосновная кислота, образующаяся в результате анаэробного превращения углеводов молочнокислыми бактериями. Данную кислоту применяют в пищевом (напитки, мармелады, консервирование), химическом (пластмассы, красители, лаки) и фармацевтическом производствах. В 1847 г. С. Блодно доказал, что данная кислота является продуктом брожения. Образование молочной кислоты из глюкозы возможно двумя путями:  при ее сбраживании гомоферментными молочнокислыми бактериями;  гетероферментный путь включает распад глюкозы до пировиноградной кислоты и ее восстановление до молочной кислоты. В биотехнологическом производстве молочной кислоты используют гомоферментные молочнокислые бактерии, чаще бактерии рода Bacterium delbruckii (син. Lactobacillus delbruckii). У них только 3% субстрата превращается в клеточный материал, а остальной – трансформируется в молочную кислоту, выход которой достигает 1,5%. Теоретически из 1 моля глюкозы должно образоваться 2 моля лактата. На практике эта величина ниже, 1,8 моля, т.е. выход продукта от субстрата составляет 90%. Вначале имеет место гликолиз (рис. 3), затем пировиноградная кислота восстанавливается с помощью лактатдегидрогеназы. Рис. 3. Схема биосинтеза молочной кислоты Молочнокислое брожение протекает в анаэробных условиях. Однако, лактобациллы относятся к факультативным анаэробам, поэтому в процессе ферментации воздух полностью из ферментеров не удаляют. В качестве сырья используют сахарную и тростниковую мелассу, гидролизаты крахмала. При этом концентрация сахаров в среде в зависимости от характера брожения составляет 5–20%. Используют восстановленные формы азота, сульфаты или фосфаты аммония, а также солод и кукурузный экстракт в качестве факторов роста. Ферментацию проводят в глубинной культуре при значениях рН 6,3–6,5 и температуры 48–50 С. Продолжительность процесса составляет 7–11 суток. В ходе брожения для коррекции изменяющейся величины рН в среду вносят мел (3–4 раза в сутки). Конечная концентрация образующегося лактата кальция составляет 10–15%, остаточная концентрация сахаров – 0,5–0,7%. На постферментационной стадии культуральную среду нагревают до температуры 80–90 С и нейтрализуют гашеной известью до слабощелочной реакции. После отстаивания в течение 3–5 ч взвешенные частицы декантируют. Затем раствор лактата кальция подают на фильтр-пресс. Фильтрат упаривают до концентрации 27–30%, охлаждают до температуры 25–30 С и выдерживают в кристаллизаторах в течение 36–48 ч. Промытый лактат кальция отделяют центрифугированием и подвергают расщеплению серной кислотой при температуре 60–70 С. Сырую молочную кислоту 18–20% концентрации упаривают в несколько этапов в вакуум-выпарных аппаратах до 70% концентрации. Кислоту после фильтр-пресса подают на розлив с внесением небольших количеств мела. При этом около 10% кислоты превращается в кристаллический лактат, связывающий молочную кислоту. Для отделения ионов железа сырец молочной кислоты при температуре 65 °С обрабатывают желтой кровяной солью (выпадает берлинская лазурь), а тяжелые металлы осаждают сульфатом натрия. Для адсорбции красящих веществ используют уголь активированный, затем фильтруют под давлением 800–920 кПа. Молочную кислоту дополнительно еще раз обрабатывают углем активированным, фильтрую и фасуют.

14. Получение уксусной кислоты биотехнологическим способом.

Продуцентами уксусной кислоты являются уксуснокислые бактерии рода Acetobacter. Эти бактерии приспособлены к сахаристым и спиртовым субстратам, растут при сильно кислых условиях (рН = 4,0). К быстроокисляющим бактериям относят высокопроизводственный штамм Acetobacter curvum (курвум).

В качестве сырья для получения пищевого уксуса используют виноградное вино, пивное сусло, мед, соки различных фруктов и ягод после спиртового брожения или водный раствор этилового спирта для получения белого уксуса. Кроме спирта среда содержит уксусную кислоту и минеральные соли N, P, S, Mn, K. Иногда добавляют источники витаминов в виде различных экстрактов. Уксусная кислота служит источником углерода и энергии для бактерий.

Этот способ может быть непрерывным и периодическим. В течение длительного времени применяется адсорбирование уксуснокислых бактерий на древесной стружке, древесном угле, коксе и других субстратах. Пропуская раствор этанола через генераторы с иммобилизованными бактериями, получают 10-15 %-ный раствор уксусной кислоты. Из 100 л безводного спирта теоретически должно быть получено 103 л уксусной кислоты. На практике выход уксуса из 100 л этанола редко превышает 90 л, что связано с переокислением и неполным окислением этанола бактериями, а также с его испарением.

В столовом уксусе содержится 5-9 % уксусной кислоты. Уксус с концентрацией кислоты 20-30 % получают путем вымораживания исходного раствора. Путем перегонки получают 70-80 %-ную уксусную кислоту, называемую уксусной эссенцией. Ледяная уксусная кислота содержит 98,0-99,8 % кислоты.

Уксусную кислоту или уксус широко используют в пищевой промышленности. Уксус, полученный микробиологическим путем (пищевая уксусная кислота, столовый уксус), различается по сортам в зависимости от характера сбраживаемого субстрата. Известен яблочный, виноградный, грушевый и другие сорта уксуса.

15. Получение и использование аминокислот.

 Существует несколько способов получения аминокислот. При производстве аминокислот могут быть использованы отходы мясоперерабатывающей промышленности (отходы обработки животного сырья, кровь и т.д.), яичный белок, казеин молока, клейковина пшеницы, соевый шрот и т.д. При переработке этого сырья все аминокислоты переходят в гидролизат, и для выделения отдельных аминокислот необходима сложная многостадийная очистка. Кроме того, само сырье считается дефицитным и дорогим, поэтому аминокислоты имеют высокую себестоимость.

Химический синтез аминокислот достаточно эффективен, однако его недостатком является то, что в процессе синтеза образуется смесь из биологически активной L-формы и D-изомера аминокислоты. D-форма является балластом, так как не усваивается животными и человеком, а некоторые D-формы аминокислот обладают токсическими свойствами. Разделение изомеров – дорогая и трудоемкая процедура. Синтетически производится незаменимая аминокислота метионин.

В настоящее время большую часть аминокислот производят с помощью микробного синтеза, причем микроорганизмы синтезируют только L-форму. Это значительно облегчает выделение и очистку аминокислот и позволяет получать препараты с низкой себестоимостью. Микроорганизмы, образующие аминокислоты, не накапливают их в клетке, а постоянно выделяют в питательную среду. Поэтому аминокислоты выделяют из фильтрата культуральной жидкости.

Глутаминовая кислота – первая аминокислота, полученная микробным синтезом. В промышленном производстве используют бактерии Corinebacterium glutamicum и Brevibacterium flavum и др. Условия сверхсинтеза глутамата натрия следующие.

Лизин образуют многие микроорганизмы: бактерии, актиномицеты, сине-зеленые водоросли, некоторые виды микроскопических грибов.

Триптофан образуют микроорганизмы бактериального и грибного происхождения: Aerobacter, Bacillus, Escherichia (E. coli), Sacсharomyces (S. сerevisiae), Candida и другие.

Некоторые аминокислоты используют в качестве приправ, так как они обладают определенными вкусовыми свойствами и могут сообщать продукту приятные аромат и вкус. Большое распространение имеет глутаминовая кислота и ее натриевая соль (глутамат натрия), которая является эффективным усилителем вкуса мясных и овощных блюд. Данную аминокислоту добавляют во многие продукты при консервировании, замораживании и длительном хранении. Растет спрос на глицин и аланин, которые также применяют в качестве приправ.

16. Получение липидов с помощью микроорганизмов.

С помощью микроорганизмов можно получать липиды. Продуцируемые микроорганизмами липиды накапливаются внутри клетки в виде запасных гранул. Требования при отборе продуцентов липидов те же, что и для продуцентов белка, только вместо белка в клетке должны накапливаться липиды. Кроме того, ряд продуцентов в отличие от продуцентов белка (в частности, дрожжей) требуют асептических условий при выращивании.

Производство липидов с помощью микроорганизмов возможно по двум направлениям: специализированное производство, основанное на направленном биосинтезе липидов микробной клеткой, и получение отхода производства в виде микробного жира при производстве кормовых дрожжей.

В производстве, где главным, целевым продуктом являются микробные липиды, в качестве продуцентов используют дрожжи родов Cryptococcus, Rhodotorula, Lypomyces, Candida. Среди этой группы дрожжей наибольшей продуктивностью обладают следующие виды: Cryptococcus terricolus, Rhodotorula gracilis, R. glutinis, Lypomyces starkeyi, L. lipoferus и др. Микроорганизмы выращиваются при минимальном азотистом питании. В этом случае они накапливают значительные количества (от 35 до 55 % от сухой массы клетки) липидов, состав которых зависит от используемого источника углерода. В липидную фракцию входят фосфолипиды, стерины, свободные жирные кислоты, моно-, ди- и триглицериды, стериновые эфиры и воски. Липиды извлекают экстракцией, а оставшуюся биомассу используют как белковую добавку в корма животных, однако содержание белка в ней в 1,5-2,0 раза меньше, чем в обычных кормовых дрожжах.

Источником получения липидов может быть биомасса дрожжей (в основном рода Candida), накапливаемая при производстве белковых веществ, но содержащая повышенное количество жиров, которые извлекают экстракцией растворителями.

В настоящее время значительное количество растительных и животных жиров расходуется на технические нужды. Замена пищевых жиров микробными дает заметный экономический эффект.

17. Производство и применение витаминов.

С помощью микробного синтеза в настоящее время получают такие витамины, как некоторые витамины группы В: В₁₂, В₂, каротиноиды, витамин D и другие.

Витамин В₁₂(цианкобаламин). Особенность витамина В₁₂ по сравнению с другими витаминами группы В определяется двумя причинами: во-первых, в природе он синтезируется только микроорганизмами, во-вторых, молекула витамина состоит из 2-х частей: кобальтосодержащей и нуклеотидной.

В тканях животных концентрация витамина очень низкая (в печени быка 1 мг/ кг) для того, чтобы использовать этот источник для промышленных целей. Химический синтез очень сложен.

Синтезировать витамин В₁₂ способны уксуснокислые бактерии, грибы и пропионовокислые бактерии. Наибольшее промышленное значение имеют Propionibacterium и Pseudomonas (P. denitrificans).

Концентрат витамина В₁₂ предназначен для обогащения кормов животных. Он представляет собой однородный порошок коричневого цвета, кисловатый на вкус, имеет характерный запах. Для обогащения кисломолочных продуктов витамином В₁₂ используют пропионовокислые бактерии как в чистом виде, так и в виде концентрата, приготовленного на молочной сыворотке.

Витамин В₂ (рибофлавин) можно в небольших количествах выделять из природного сырья. В наибольшем количестве он содержится в моркови и печени трески.

Из 1 т моркови получают 1 г витамина, из 1 т печени – 6 г.

Рибофлавин впервые был выделен в кристаллическом виде в 1933 г. Продуцентами данного витамина являются дрожжи, мицелиальные грибы и бактерии. Наиболее активными продуцентами витамина В₂ являются дрожжеподобные грибы рода Eremothecium (эремофекиум), входящие в класс аскомицетов. Культивирование проводят глубинным способом при хорошей аэрации. Максимальное накопление витамина происходит вместе с максимумом накопления биомассы на 2-е сутки, причем синтез рибофлавина начинается лишь после фазы интенсивной ассимиляции сахара.

Витамином В₂ обогащают некоторые сорта белого хлеба, его используют для окраски пищевых продуктов в оранжево-желтый цвет.

Каротиноиды – это предшественники витамина А, среди которых наиболее активен -каротин. В организме человека каротиноиды не синтезируются, поэтому должны поступать извне. В печени каротин превращается в витамин А.

Продуцентами каротиноидов могут быть грибы и дрожжи. В промышленности -каротин чаще всего получают с помощью микроскопического гриба рода Blakeslea (блакеслеа). Культивирование проводят и поверхностным, и глубинным способами на питательных средах сложного состава. Во время ферментации среду интенсивно аэрируют. Образование каротиноидов в культуре микроорганизмов не идет параллельно с образованием биомассы. Интенсивный синтез каротиноидов начинается, когда в среде использован весь азот, а рост культуры уменьшается. В качестве стимуляторов в питательные среды добавляют экстракты цитрусовых и дрожжей.

-каротин используют при изготовлении пищевых продуктов как краситель. Его применяют при изготовлении колбас с целью замены нитрита натрия и обеспечения высокой интенсивности и устойчивости цвета. Используют при производстве леденцов, пищевых паст, кексов и других кондитерских изделий. Во многих странах -каротин применяют для подкрашивания сливочного масла. Нагревают до 30 С, добавляют -каротин, который при такой температуре хорошо растворяется в масле. В Италии каротиноиды используют в производстве макаронных изделий.

-каротин применяется для стабилизации цвета мяса охлажденного и замороженного в тушах. С этой целью раствор -каротина наносят на поверхность мяса.

Кроме того, -каротин обладает антиокислительными свойствами, которые используются для продления срока хранения продукта.

Таким образом, витамины, синтезированные микроорганизмами, используют не только для повышения пищевой ценности продуктов питания, но также в качестве антиоксидантов, красителей и стабилизаторов цвета.

18. Получение ферментных препаратов из сырья растительного и животного происхождения, их использование в пищевой промышленности.

5.2. Получение ферментных препаратов из сырья растительного происхождения

Для получения ферментных препаратов пригодны только некоторые растения или отдельные органы растений и животных, способные накапливать значительное количество ферментов. Источники некоторых ферментов приведены в табл. 5.1.

Таблица 5.1

Источники ферментов растительного происхождения

Из ферментов растительного происхождения наиболее широко в пищевой промышленности используют амилазы и папаин. Источником ферментов могут быть пророщенные зерна различных злаков. Условно ферментным препаратом можно считать и ячменный солод, в котором содержится до 1 % амилаз.

Растительная протеаза – папаин – содержится в плодах дынного дерева. Только в США ежегодно расходуют около 1 т папаина для обработки (размягчения) мяса. Папаин, а также протеазы фицин и бромелаин при контакте с мясом в течение 2 ч при комнатной температуре расщепляют белки соединительной ткани – коллаген и эластин.

Из растительного сырья получают также фосфатазы, пероксидазы, уреазы, гемицеллюлазы и другие ферменты.

5.3. Получение ферментных препаратов из сырья животного происхождения

Органы и ткани животных (поджелудочная железа, слизистые оболочки желудков и тонких кишок свиней и т.п.), содержащие ферменты, на мясоперерабатывающих комбинатах консервируют и используют для получения ферментов. Из слизистой желудка свиней и крупного рогатого скота получают препарат пепсина. Из поджелудочной железы свиней получают панкреатин, смеси трипсина, химотрипсина, липаз и амилаз. Пепсин, трипсин и химотрипсин применяют для размягчения мяса, однако бόльший эффект получен при обработке мяса панкреатином. Из желудка (сычуга) молодых телят выделяют сычужный фермент (реннин), широко используемый в сыроделии. Сычужный фермент осуществляет процесс превращения жидкого молока в гель (сгусток), а кроме того участвует в протеолизе, происходящем в сыре при созревании. Некоторые наиболее известные ферменты животного происхождения, а также органы и ткани животных, из которых их получают, представлены в табл. 5.2.

Таблица 5.2

Источники ферментов животного происхождения