Автореферат: Влияние вакцины Гриппол на радиорезистентность организма

Состояние системы синтеза б - и г - ИФН у животных определяли по уровню продукции этих цитокинов лейкоцитами, выделенными из периферической крови, после воздействия вирусным индуктором - вирус болезни Ньюкастла (ВБН) в дозе 1-10 цитопатических доз (ЦПД) на 1 лейкоцит для б - интерферона и митогеном - фитогемагглютинин (ФГА) в дозе 1-10 ед/мл для г - интерферона. Определение активности синтезируемого лейкоцитами ИФН у мышей и собак проводили путем титрования на культуре клеток костно-мышечной ткани эмбриона человека (диплоидный кариотип) против вируса энцефаломиокардита мышей (ЭМС). Активность ИФН у привитых добровольцев оценивали методом двухстадийного иммуноферментного анализа. На первой стадии анализа исследуемые и контрольные образцы инкубировали в лунках с иммобилизованными антителами. Имеющийся в образцах б -ИФН связывается с иммобилизованными антителами. Несвязавшийся материал удаляли отмывкой. Связавшийся б -ИФН взаимодействует при инкубации с конъюгатом антител к б -ИНФ человека с пероксидазой хрена. После второй отмывки количество связавшегося конъюгата определяли цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы хрена - перекиси водорода и хромогена - тетраметилбензидина. Реакцию останавливали добавлением раствора серной кислоты и измеряли оптическую плотность растворов в лунках при длине волны 450 нм. Интенсивность желтого окрашивания пропорциональна количеству содержащегося в образце б -ИФН. Титр б - и г -ИФН определяли по калибровочной прямой.

Методы статистического анализа.

Полученный цифровой материал обработан с помощью общепринятых методов вариационной статистики, а также встроенного пакета статистического анализа MS Excel 2003. Достоверность различий сравниваемых средних величин оценивали по t-критерию Стьюдента. Для выявления корреляций вычислялся стандартный коэффициент корреляции. Достоверность данных, полученных по выживаемости животных, оценивали методами ч2 и критерием Фишера.

Расчет точности прогноза выживаемости облученных в летальной дозе животных в зависимости от исходного уровня сывороточного ИФН проводили по тесту Т. Шеллинга-Вольфеля (Малета Ю.С., Тарасов В.В., 1982).

Результаты и обсуждение

3.1 Противолучевое действие Гриппола

В экспериментах по исследованию влияния Гриппола на выживаемость мышей, облученных в дозе 7,5 Гр, были получены следующие данные. Введение Гриппола за 14 суток до облучения повышает выживаемость мышей в опытной группе на 60%, по сравнению с контрольной. Эффект статистически значим: ч2=5,2 p=0,02. Менее эффективно введение вакцины за 7 суток. Выживаемость защищенных мышей на 25% выше таковой в контроле. Эффект статистически не значим по сравнению с контрольной группой. Результаты проиллюстрированы в таблице 1.

Таблица 1 - Выживаемость мышей, защищенных Грипполом в дозе 0,2 мл до облучения гамма-квантами 137Сs в дозе 7,5 Гр.

Полученные результаты подтверждаются данными по динамике массы тела. Из таблицы 2 видно, что у мышей, облученных в дозе 7,5 Гр, отмечается четко выраженное падение массы тела, тогда как в опытной группе, защищенной Грипполом в дозе 0,2 мл, отмечается меньшая глубина снижения массы тела на 15-е сутки после облучения. Соответственно, масса мышей на 15 сутки ОЛБ в опытной группе составляла 22,4±0,4 г, в контрольной - 20,4±0,8 г. Как известно, наиболее важным показателем в проявлении радиобиологического эффекта является состояние периферической крови. Результаты оценки влияния вакцины Гриппол на состав периферической крови мышей представлены в таблице 3. Получены статистически достоверные данные: у мышей, защищенных вакциной Гриппол, введенной в дозе 0,2 мл за 14 суток до облучения, а так же - в дозе 6,0 Гр, на 8 сутки течения ОЛБ, содержание нейтрофилов, ретикулоцитов, эритроцитов и гемоглобина в периферической крови выше, по сравнению с мышами контрольной группы.

Таблица 2 - Динамика массы тела у мышей, защищенных вакциной Гриппол, вводимой за 7 суток до облучения гамма-квантами 137Сs в дозе 7,5 Гр (М±m, г)

Примечание. * статистически значимая разница по сравнению с контролем, критерий Стьюдента, р<0,05.

Как известно, наиболее важным показателем в проявлении радиобиологического эффекта является состояние периферической крови. Результаты оценки влияния вакцины Гриппол на состав периферической крови мышей представлены в таблице 3. Получены статистически достоверные данные: у мышей, защищенных вакциной Гриппол, введенной в дозе 0,2 мл за 14 суток до облучения, а так же - в дозе 6,0 Гр, на 8 сутки течения ОЛБ, содержание нейтрофилов, ретикулоцитов, эритроцитов и гемоглобина в периферической крови выше, по сравнению с мышами контрольной группы.

Таблица 3 - Влияние вакцины Гриппол, введенной в дозе 0,2 мл за 14 суток до облучения мышей в дозе 6,0 Гр (СД 10/30), на показатели периферической крови.

Примечание. * статистически значимая разница по сравнению с контролем, критерий Стьюдента, р<0,05.

Суммируя вышеизложенное, следует отметить, что вакцина Гриппол, введенная в дозе 0,2 мл за 14 суток до облучения, оказывает благоприятное влияние на состояние периферической крови облученных мышей и способствует более интенсивному восстановлению массы тела в период ОЛБ. Полученные данные полностью согласуются с литературными сведениями по хроматографической вакцине (Иванов А.А. и соавт.,1995).

В экспериментах на 15 собаках, разделенных на опытную и контрольные группы - 7 и 8 животных соответственно, и облученных в дозе 2,5 Гр, статистически достоверных различий по тесту выживаемости не отмечено. Однако наблюдается положительное влияние Гриппола, введенного до облучения, на показатели периферической крови. Данные представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Влияние вакцины Гриппол на динамику показателей периферической крови у собак, облученных в дозе 2,5 Гр.

Как видно из таблицы, у облученных собак развивается существенное нарушение показателей периферической крови, отмечается выраженная лейкопения, тромбопения, увеличение СОЭ. Тогда как у собак в опытной группе, иммунизированных Грипполом за 16 суток до облучения в дозе 0,5 мл, наблюдается определенное восстановление числа форменных элементов периферической крови, что особенно четко прослеживается по определению увеличения содержания количества лейкоцитов в восстановительный период (рисунок 1,2).

Рисунок 1 - Динамика содержания лейкоцитов периферической крови у собак, облученных в дозе 2,5 Гр.

Рисунок 2 - Содержание лейкоцитов в периферической крови собак иммунизированных вакциной Гриппол и облученных (1) и только облученных гамма-квантами в дозе 2,5 Гр (2)

Представленные данные свидетельствуют о благоприятном влиянии вакцины Гриппол на динамику восстановления показателей периферической крови.

Подводя итог, следует отметить, что вакцина Гриппол, введенная в дозе 0,2 мл за 14 суток до облучения (6 Гр и 7,5 Гр), статистически достоверно повышает выживаемость облученных в летальной дозе мышей, положительно влияет на динамику массы тела и показатели периферической крови. Введение Гриппола собакам в дозе 0,5 мл за 16 суток до облучения в дозе 2,5 Гр, оказывает положительное влияние на скорость восстановления показателей периферической крови.

Специфический ответ на иммунизацию Грипполом необлученных мышей и собак.

При однократной иммунизации мышей вакциной Гриппол в дозах, применяемых в радиобиологических экспериментах, удалось зарегистрировать наличие иммунного ответа невысокой интенсивности. Результаты исследования проиллюстрированы на рисунке 3. Представлена динамика титров антител к трем штаммам, входящим в состав вакцины Гриппол в эпидемическом сезоне 2005-2006г.г: A/New Caledonia (H1N1), A/New York (H3N2) и B/Jiangsu.

Рисунок 3 - Среднее геометрическое титра АТ к гемагглютинину различных штаммов вируса гриппа у мышей, однократно иммунизированных вакциной Гриппол в дозе 0.2 мл.

Как видно на рисунке 3, для штаммов типа А титр антител растет, начиная с 7 дня, и достигает защитного титра (1:40) к 14 суткам (для H1N1) и 28 (H3N2) дням. Уровень антител к гемагглютинину штамма B/Jiangsu также возрастает, однако более плавно и не достигает уровня защитного титра в течение наблюдаемого периода. Известно, что по вирулентности, эпидемической значимости и иммуногенности вирусы гриппа типа В уступают вирусам гриппа типа А (Карпухин Г.И, 2001; Hu YM .,2005). Поэтому, по-видимому, однократной иммунизации в низкой дозе оказалось недостаточно для этого штамма.

При однократной иммунизации вакциной Гриппол собак в дозе 0,5 мл максимальные значения титров АТ к штаммам вируса грипп A/New Caledonia (H1N1) и A/New York (H3N2) регистрировались на 35 сутки после введения вакцины. Хотя защитных значений титры не достигали, можно с уверенностью говорить об активации специфического звена иммунитета. Результаты представлены на рисунке 4.

Рисунок 4 - Среднее геометрическое титра АТ к гемагглютинину различных штаммов вируса гриппа у собак, однократно иммунизированных вакциной Гриппол в дозе 0.5 мл.

Титры АТ к штамму A/New Caledonia (H1N1) начинают расти на 7 сутки, а к штамму A/New York (H3N2) к 14 суткам. Исходно высокие и колеблющиеся на протяжении всего исследования титры АТ к штамму B/Jiangsu можно объяснить таксономической близостью вируса гриппа типа В к вирусу парагриппа собак и отсутствием в этой связи выраженного ответа на иммунизацию.

Интерфероногенные свойства вакцины Гриппол

Результаты динамического наблюдения интерферонсинтезирующей активности лейкоцитов крови иммунизированных животных и добровольцев представлены на рис 5 (а, б,в) и рис 6 (а, б,в). Установлено, что титры б - ИФН у мышей достигают максимальных значений на 7 сутки (435,2 ед./мл) (рис 5а), а у собак на 14 сутки (480 ед./мл) (рис 5б) после введения вакцины. Максимальные титры г - ИФН у мышей определялись на 28 сутки (>40 ед./мл) (рис 6а) и у собак на 21 сутки (25,6 ед/мл) (рис 6б). Рассматривая динамику системы б - ИФН, полученную в группе обследованных добровольцев можно проследить общую направленность, как у животных так и у человека, в изменении системы ИФН после иммунизации вакциной Гриппол.