03.01.01 - Радиобиология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Влияние вакцины Гриппол на радиорезистентность организма
Рогожин Дмитрий Владимирович
Москва - 2010
Работа выполнена на базе Федерального государственного учреждения "Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна ФМБА России"
Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор
Иванов Александр Александрович
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, Осипов Андреян Николаевич
доктор биологических наук, Штемберг Андрей Сергеевич
Ведущая организация: "Объединенный институт ядерных исследований", г. Дубна.
Защита состоится часов на заседании диссертационного совета Федерального государственного учреждения "Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна ФМБА России" по адресу: 123182, г. Москва, ул. Живописная, д.46
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук профессор Н.К. Шандала
Общая характеристика работы
Актуальность исследования
Возможность повышения устойчивости организма к поражающему действию ионизирующего излучения с помощью вакцин известна давно (Клемпарская Н.Н., Раева Н.В. и Сосова В.Ф., 1963) . При этом установлено, что противолучевой эффект наблюдается при использовании бактериальных и вирусных вакцин как при профилактическом, так и при лечебном их применении. Возможность использования для этих целей гриппозной вакцины, применяемой для иммунизации населения, продемонстрирована на инактивированной хроматографически чистой (тип А 1 и А 2) вакцине производства Омутнинского химического завода Кировской области (Иванов А.А. и соавт.,1995) . Показано, что профилактическое введение этой вакцины повышало выживаемость облученных и защищенных животных по сравнению с незащищенными на 25-40 %. Однако, данная вакцина снята с производства в связи с ее слабыми специфическими иммуногенными свойствами. вакцина вирусный бактериальный
В настоящее время для иммунизации населения широко применяется вакцина Гриппол, разработанная сотрудниками Государственного научного центра - Института иммунологии ФМБА России. На данный момент вакциной иммунизировано уже более 40 млн. человек. Разработчики вакцины установили, что Гриппол не только формирует специфический противовирусный иммунитет, но и повышает устойчивость организма человека к другим острым респираторным заболеваниям (Хаитов Р.М. и соавт.,2001) Однако, механизмы этой устойчивости до конца не расшифрованы. В связи с этим, представлялось актуальным исследовать динамику интерферонового статуса организма под влиянием вакцины Гриппол, поскольку система ИФН является одной из важнейших систем, обеспечивающих неспецифическую противовирусную резистентность организма.
К моменту начала работы не было обнаружено каких-либо публикаций, посвященных влиянию вакцины Гриппол на интерфероновый статус организма. В рассмотренных нами публикациях остается не изучен вопрос о противолучевой эффективности Гриппола, как вакцины массового применения, и установлении механизма повышения радиорезистентности под влиянием вакцины, что, безусловно, является актуальным и имеет не только научный, но и практический интерес.
Цель работы
Определить способность вакцины Гриппол повышать радиорезистентность, а также роль иммунологических механизмов в противолучевом действии данной вакцины.
Основные задачи исследования:
· Исследовать противолучевое действие вакцины Гриппол.
· Исследовать влияние вакцины Гриппол на интерфероновый статус животных и человека.
· Исследовать влияние вакцины Гриппол на специфический иммунный ответ.
· Установить коррелятивные связи между уровнем интерферонов и радиорезистентностью организма.
· Обосновать возможность переноса данных о противолучевом действии вакцины Гриппол с животных на человека.
Научная новизна
Впервые изучено влияние вакцины Гриппол на радиорезистентность организма. Показано, что вакцина, введенная в дозе 0,2 мл за 14 суток до облучения (7,5 Гр), статистически достоверно повышает выживаемость мышей в опытной группе по сравнению с контрольной, на 25% и 60%, и положительно влияет на динамику массы тела, показатели периферической крови мышей при облучении в минимальной летальной дозе (6 Гр).
Введение Гриппола собакам в дозе 0,5 мл за 16 суток до облучения в дозе 2,5 Гр, оказывает положительное влияние на скорость восстановления показателей периферической крови.
Впервые выявлена взаимосвязь между уровнем противолучевой резистентности и содержанием сывороточного ИФН в периферической крови организма. Показано, что темпы падения содержания лейкоцитов периферической крови у сублетально облученных собак ниже в группе с исходно высоким до облучения содержанием ИФН в сыворотке по сравнению с аналогичными показателями в группе с низким содержанием ИФН в сыворотке.
Разработаны критерии переноса данных о противолучевых свойствах Гриппола с животных на человека. Согласно нашим данным, повышенное содержание сывороточного ИФН в сыворотке крови перед облучением повышает выживаемость животных
Положения, выносимые на защиту
· Вакцина Гриппол обладает противолучевыми свойствами.
· Вакцина Гриппол активирует процессы интерфероногенеза в организме животных и человека.
· Периоды повышения радиорезистентности, формируемые после иммунизации вакциной Гриппол, совпадают со временем повышения интерферонсинтезирующей активности клеток крови.
Практическая значимость
Результаты данного исследования позволяют рекомендовать Гриппол как препарат двойного действия - антигриппозного и как средство повышения радиорезистентности. Вакцина может быть предназначена, в частности, для иммунизации работников атомной промышленности, личного состава Российской Армии, сотрудников МЧС и других групп риска радиационного воздействия. Основываясь на данных о повышении интерферонсинтезирующей способности лейкоцитов крови после иммунизации у человека (7-56 сутки) и у животных (7-21 сутки), а также на данных о том, что в период 7-21 суток у животных отмечено повышение радиорезистентности можно прогнозировать повышение радиорезистентности у человека в период 7-56 суток после иммунизации.
Экспериментальные данные, приведенные в диссертационной работе, включены в методические рекомендации по использованию показателей интерферонового статуса для прогнозирования радиорезистентности и методические рекомендации по применению вакцины "Гриппол" для повышения неспецифической противолучевой резистентности.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на ХIV Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство",
VI Всероссийском конгрессе "Профессия и здоровье" и на научной конференции отдела №1 Федерального государственного учреждения Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна ФМБА России.
Публикации
По теме диссертации опубликованы 5 печатных работ (из них 2 статьи) в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура диссертационной работы:
Диссертация состоит из введения, трех глав собственных исследований, обсуждения результатов и выводов. Работа изложена на 98 страницах, иллюстрирована 8 таблицами и 16 рисунками. Библиографический указатель включает в себя 123 наименования печатных источников, из них 31 на иностранных языках.
Материалы и методы
Экспериментальные животные
Исследования проводили на мышах CBA??С 57B1 (F1) самцах (масса тела 20-21г) и беспородных собаках обоего пола (масса тела 13-24 кг). Во время экспериментов животные содержались в условиях вивария, соответствующих санитарным нормам (рекомендованный рацион, свободный доступ к питьевой воде), при естественном фоне освещенности и температуре воздуха 20-22оС.
Все работы проведены в соответствии с "Общими положениями по соблюдению стандартных условий проведения опытов на животных в ИБФ" и "Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных" (Приказ Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977).
Эксперименты выполнены на 346 мышах и 15 собаках.
Группа добровольцев
Исследование влияния вакцины Гриппол на интерфероновый статус проводилось на 12 добровольцах. Группа состояла из 2 мужчин и 10 женщин в возрасте 22-30 лет, иммунизированных вакциной Гриппол (серия С Н 2-0906, производитель ФГУП НПО "Микроген") в эпидемическом сезоне 2008 года. Одна иммунизирующая доза Гриппола (0,5 мл) содержит по 5 мкг гемагглютинина штаммов вирусов гриппа типов A (H1N1), A (H3N2), 11 мкг вируса гриппа типа В и 500 мкг полиоксидония. Вакцина является высокоочищенным препаратом, свободным от примесей невирионного происхождения. Консервант - мертиолят от 85 до 115 мкг/мл.
Оценка радиопротекторных свойств вакцины Гриппол.
Тотальное облучение мышей и собак проводили гамма-квантами 137Сs на установке ИГУР. Мощность дозы 1,2- 2,0 рад/сек. Контроль за мощностью дозы и ее пространственным распределением проводили с помощью термолюминисцентного дозиметра ИКС-А с использованием термолюминисцентного алюмофосфатного стекла ИС-7 с погрешностью ±10 %. В качестве модели использовали однократное равномерное радиационное воздействие, вызывающее костномозговую форму острой лучевой болезни различной степени тяжести. Использованы дозы облучения с различной биологической активностью: 6,0 (СД 10/30) и 7,5 (СД 70/30) Гр для мышей и 2,5 Гр - для собак (СД 30/45).
В качестве радиозащитного средства использовали Гриппол, оценивали влияние вакцины на выживаемость и динамику массы тела мышей на 30 сутки течения ОЛБ, а также выживаемость собак на 45 сутки после облучения. Состав периферической крови облученных животных определяли с использованием гематологического анализатора Alcon-6. Гриппол вводили мышам однократно подкожно в область задней лапы в дозе - 0,5; 0,2 и 0,05 мл за 7 или 14 суток до облучения. Собак иммунизировали подкожно в область предплечья за 16 суток до облучения, доза вакцины - 0,5 мл. Контрольным животным вводили официнальный 0,9% раствор хлорида натрия - мышам 0,2 мл, собакам -0,5 мл.
Специфический ответ на иммунизацию Грипполом необлученных мышей и собак.
Для изучения специфического иммунного ответа использовалась однократная иммунизация вакциной Гриппол, мышей в дозе 0,2 мл, собак - 0,5 мл. Сроки забора крови - до иммунизации на 1,7,14,28,35 сутки.
Оценка интерфероногенных свойств вакцины Гриппол.
В эксперименте по оценке интерфероногенных свойств Гриппола облучение животных не проводилось. Мышей вакцинировали однократно внутрибрюшинно в дозе 0,2 мл. Интерфероновый статус определяли через 4 часа спустя 1, 7, 14 и 28 суток после введения вакцины. Собак иммунизировали однократно в область предплечья в дозе 0,5 мл. Забор крови проводили через 7,14,21,28,35 суток. Добровольцев иммунизировали однократно в дельтовидную мышцу (доза вакцины - 0,5 мл). Обследование проводили через 1,7,14,28 и 60 суток.
Анализ взаимоотношений уровня радиорезистентности и интерферонового статуса.
Эксперимент проводили на 15 собаках обоего пола, массой тела 12-15 кг. Животных подвергали воздействию г-лучей 137Сs в дозе 2,5 Гр (СД 30/45). До облучения у животных определяли содержание ИФН в сыворотке крови и состав периферической крови. На 7-е, 14-е, 21-е, 28-у и 35-е сутки после облучения определяли клеточный состав периферической крови и скорость оседания эритроцитов. После облучения животных разделили на две группы - согласно исходным значениям сывороточного ИФН - титр ИФН ? 8 и титр
ИФН < 8. Затем провели сопоставление показателей выживаемости облученных собак и скорости восстановления гемопоэза с исходным уровнем сывороточного ИФН.
Схема исследования влияния вакцины Гриппол на интерферонсинтезирующую активность клеток периферической крови и специфический иммунный ответ.
Добровольцев и животных иммунизировали вакциной Гриппол за 7 и 14 суток до облучения. Мышам вводили подкожно по 0,2 мл, собакам - по 0,5 мл, добровольцам - по 0,5 мл вакцины. Обследование контрольных и опытных мышей проводили на каждом сроке опыта (динамический контроль), через 4 часа, 1, 7, 14 и 28 суток после иммунизации. Добровольцев и собак, предварительно обследовали до иммунизации, для определения титров сывороточного ИФН и интерферонсинтезирующей активности клеток крови, а затем в динамике исследования. Забор крови у собак проводили через 1,7,14,21,28,35 суток после введения вакцины и у добровольцев - через 1,7,14,28 и 56 суток. Одну часть полученных от экспериментальных животных проб использовали для определения в сыворотке крови уровня специфических антител методом РТГА (реакция торможения гемагглютинации), в другую часть добавляли гепарин (5 ед/мл) и определяли способность лейкоцитов крови продуцировать б - и г - ИФН после взаимодействия с индукторами.
Количественную оценку уровня специфических антигемагглютининовых антител проводили в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) в соответствии с МУ 3.3.2. 1758-03 "Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа"