При статистическом анализе как в эпидермисе, так и в периваскулярных инфильтратах пораженной кожи больных выявлено более высокое содержание CD8+ лимфоцитов, по сравнению с таковым в группе здоровых добровольцев (табл. 2; P<0,001). Количество СD8+ лимфоцитов в очагах склеродермии оказалось в 2,3 раза выше количества СD4+ клеток.
Реакция к антигену CD25 (рецептору ИЛ-2) в коже здоровых лиц была отрицательной как в эпидермисе, так и в дерме. В эпидермисе больных СD25+ клетки также отсутствовали, однако в дерме они в значительном количестве
выявлялись в клетках периваскулярных инфильтратов поверхностного сосудистого сплетения; единичные окрашенные клетки встречались среди коллагеновых волокон. При статистическом анализе содержание СD25+ клеток в периваскулярных инфильтратах оказалось значительно повышенным, по сравнению с показателем в группе здоровых добровольцев (табл. 2; Р<0,001).
HLA-DR+ клетки и в группе здоровых добровольцев, и в группе больных выявляли как в эпидермисе, так и в дерме в виде конгломератов клеток с переплетающимися отростками. Различий в содержании этих клеток в эпидермисе здоровых лиц и больных не обнаружено, однако в периваскулярных инфильтратах у больных их количество почти в 4 раза превышало таковое в контрольной группе (P=0,002). При корреляционном анализе каких-либо статистически значимых связей содержания указанных клеток с клиническими показателями не выявлено.
После курса УФА-1 терапии в эпидермисе больных выявлено двукратное снижение содержания СD8+ лимфоцитов, однако полной нормализации данного показателя не наблюдалось (табл. 2). Экспрессия молекул HLA-DR в эпидермисе значительной динамике под действием лечения не подвергалась. В периваскулярных инфильтратах количество СD4+ лимфоцитов статистически значимо не изменялось, тогда как содержание СD8+ лимфоцитов достоверно уменьшалось (P=0,022). Тем не менее, после лечения уровень СD8+ лимфоцитов оставался более высоким, чем в группе здоровых лиц. Количество СD25+ и HLA-DR+ клеток в периваскулярных инфильтратах кожи после лечения статистически значимо снижалось, но также оставалось повышенным.
Следует подчеркнуть, что указанные изменения иммунологических показателей у 9 из 10 больных наблюдались на фоне улучшения клинических симптомов заболевания.
Известно, что формирование фиброза в очагах склеродермии сопровождается хроническим воспалением (Fleishmajer R., Lebwohl M., 1986; Mauch C. et al., 1993; Black C.M. et al., 1999), одним из проявлений которого является периваскулярная и/или диффузная клеточная инфильтрация кожи. Однако роль Т-клеточного звена иммунной системы в патогенезе ограниченной склеродермии окончательно не установлена. Полученные нами данные свидетельствуют об увеличении в коже больных количества супрессорно-цитотоксических лимфоцитов, а также повышенном содержании CD25+ и HLA-DR+ клеток, что свидетельствуют об активации в коже Т-клеточного звена иммунной системы.
В доступной литературе имеются лишь единичные сведения о влиянии УФА-1 терапии на субпопуляционный состав и активацию дермальных лимфоцитов у больных ограниченной склеродермией. В наших исследованиях установлено нормализующее влияние УФА-1 терапии как на субпопуляционный состав лимфоцитов, так и на активность клеточных иммунных процессов в очагах склеродермии.
Динамика содержания профиброзных цитокинов в коже больных ограниченной склеродермией в процессе УФА-1 терапии. Согласно имеющимся литературным данным, трансформирующий фактор роста бета и тромбоцитарный фактор роста являются ключевыми медиаторами процессов фиброза. TGF-в способствует дифференцировке миофибробластов и формированию фиброгенного фенотипа фибробластов (Varga J. et al., 2004), регулирует образование PDGF, стимулирует синтез компонентов межклеточного матрикса, в том числе коллагена и фибронектина (Ignotz R.A. et al., 1987; Gay S. et al., 1992, Massague J., 1990, Wrana J.L. et al., 1994.), уменьшает продукцию ферментов, способствующих деградации компонентов межклеточного матрикса (коллагеназы, гепариназы и стромелизина), повышает синтез белков (ингибитора активатора плазменогена I типа и тканевого ингибитора металлопротеиназ), ингибирующих эти ферменты (Klareskog L. et al., 1990). Тромбоцитарный фактор роста является сильным митогеном гиперпластического роста фибробластов и участвует в стимуляции их пролиферации и миграции (Bonner J.C., 2004; Trojanowska M., 2008; Andrae J. et al., 2008).
В наших исследованиях при иммуноморфологическом анализе препаратов кожи с моноклональными антителами TGF-в1, TGF-вRI и PDGFR-б в дерме здоровых добровольцев в большинстве случаев выявляли отдельные TGF-в1+ и TGF-вRI+ клетки, которые локализовались в периваскулярных инфильтратах и вокруг волосяных фолликулов. Умеренно выраженная экспрессия PDGFR-б наблюдалась на клетках эндотелия, эпителия потовых и сальных желез, а также на фибробластах.
В коже больных отмечалась экспрессия TGF-в1 на отдельных клетках периваскулярных инфильтратов, а также в цитоплазме эпителиоцитов потовых желез, TGF-вRI в значительном количестве выявляли на клетках периваскулярных инфильтратов кожи, клетках мышц, поднимающих волос, и сальных желез. PDGFR-б обнаруживали в эпителии волосяных фолликулов, потовых и сальных желез, а также мышц, поднимающих волос. Экспрессия этого рецептора наблюдалась также на клетках периваскулярных инфильтратов и фибробластах.
При статистическом анализе полученных данных в группе больных установлено пониженное, по сравнению с группой здоровых добровольцев, содержание в дерме пораженной кожи TGF-в1+ клеток (P=0,007) и повышенное количество TGF-вRI+ (P=0,001) и PDGFR-б+ клеток (P<0,001; табл. 3).
Вопрос о роли трансформирующего фактора роста бета в патогенезе ограниченной склеродермии до настоящего времени остаётся нерешенным. В литературе имеются отдельные публикации, посвященные изучению содержания TGF-в1 в очагах ограниченной склеродермии, результаты которых противоречивы. В одних исследованиях обнаружена значительная (Higley H. et al., 1994; Querfeld C. et al., 1999; Gilmour T.K. et al., 2000) или слабая (Vuorio T. et al., 1991; Farell A.M. et al., 2001) экспрессия цитокина в коже, в других она не отличалась от таковой в здоровой коже (Restrepo J.F. et al., 2003) или отсутствовала (Oikarinen A. et al., 1991). Необходимо подчеркнуть, что большинство указанных исследований были выполнены на небольшом числе больных без статистического анализа полученных данных.
Поскольку в нашем исследовании проводился подсчет всех иммунореактивных клеток в дерме, выявленное снижение содержания TGF-в1 в коже больных может быть, по всей видимости, обусловлено уменьшением его продукции клетками, участвующими в иммунном воспалении - макрофагами, эндотелиоцитами, Т-лимфоцитами, в том числе Th3 регуляторными клетками, являющимися одним из основных пулов, синтезирующих данный ростовой фактор (Насонова В.А., Бунчук Н.В., 2001; Apostolou I. et al., 2008).
Известно, что трансформирующий фактор роста бета относится к мультифункциональным цитокинам, обладающим широким спектром действия. Он участвует не только в процессах фиброза, но и в реакциях воспаления, ангиогенезе, восстановлении поврежденных тканей (Blobe M. et al., 2000). При воздействии на иммунные реакции TGF-в выступает преимущественно в качестве супрессорного фактора, сдерживающего, в том числе, аутоиммунные процессы (Kawakami T. et al., 1998; Ярилин А.А., 1999). Показано, что он принимает участие в ингибировании гемопоэза, синтеза воспалительных цитокинов, ответа лимфоцитов на интерлейкины 2, 4, 7, подавлении образования цитотоксических NK и Т-клеток (Кетлинский С.А., Калинина Н.М., 1995; Yin L., 2003; Svegliati S.B. et al., 2005, 2006).
Выключение гена TGF-в1 у экспериментальных животных приводит к развитию фатальной генерализованной воспалительной патологии, в основе которой лежит аутоиммунный процесс (Jelaska A., Korn J.H., 2000).
Установлено, что данный ростовой фактор участвует в иммуносупрессивных реакциях, опосредованных регуляторными лимфоцитами (Wahl S.M. et al., 1988; Pyzik M., Piccirillo C.A., 2001; Marie J.C. et al., 2005; Taylor A.W., 2009). В ряде исследований у больных системной склеродермией выявлено уменьшение содержания TGF-в1 в сыворотке крови (Dziadzio M. et al., 2005), а также продукции его циркулирующими моноцитами и Т-клетками (Giacomelli R. et al., 1996; Scala E. et al., 2004). Кроме того у больных системной склеродермией обнаружено снижение супрессорной функции T-регуляторных клеток (Tregs), связанной с недостаточной продукцией этого цитокина (Radstake T.R. et al., 2009).
Исходя из приведенных данных, можно предположить, что обнаруженное в нашем исследовании пониженное количество TGF-в1 в очагах ограниченной склеродермии обусловлено уменьшением его продукции Т-клетками. Полученные нами результаты нашли подтверждение в недавно проведенных исследованиях зарубежных коллег, в которых как в крови, так и в коже больных ограниченной склеродермии выявлено пониженное содержание TGF-в и регуляторных Т-лимфоцитов (Antiga E. et al., 2010).
Известно, что биологические эффекты TGF-в и PDGF опосредуются активацией клеточных рецепторов, высоко аффинных к этим цитокинам. При анализе экспрессии рецепторов ростовых факторов в коже в группе больных нами выявлено повышенное, по сравнению с группой здоровых добровольцев, количество TGF-вRI+ (в 2, 8 раза; P=0,001) и PDGFR-б+ клеток (в 1,8 раза P<0,001). Каких-либо корреляционных связей содержания TGF-в1, TGF-вRI и PDGFR-б с клиническими показателями не выявлено.
В литературе имеется лишь одно сообщение о нарушении содержания рецепторов TGF-в в коже больных ограниченной склеродермией (Kubo M. et al., 2001), в котором методом in situ гибридизации выявлена повышенная экспрессия mRNA TGF-вRI и TGF-вRII. Установленное нами повышенное содержание TGF-вRI+ клеток в коже больных согласуется с результатами этих исследований и свидетельствует о вовлечении данного рецептора в патогенез заболевания. Работ, посвященных изучению содержания рецепторов тромбоцитарного фактора роста в коже больных ограниченной склеродермией, в доступной литературе нам не встретилось. Проведенные нами исследования свидетельствуют об участии альфа-рецепторов тромбоцитарного фактора роста в механизмах развития заболевания.
С учётом имеющихся литературных данных о вовлечении указанных ростовых факторов в фиброгенез, можно утверждать, что обнаруженное нами повышенное содержание в коже больных ограниченной склеродермией рецепторов I типа трансформирующего фактора роста бета и альфа-рецепторов тромбоцитарного фактора роста свидетельствует об активации процессов формирования фиброза в очагах поражения, а также их важной роли в патогенезе заболевания.
При анализе биоптатов, взятых у больных ограниченной склеродермией после курса УФА-1 терапии, нами не выявлено существенных изменений экспрессии и распределения TGF-в1+ клеток в коже. Экспрессия TGF-вRI значительно уменьшалась в периваскулярных инфильтратах, но сохранялась выраженной на клетках придатков кожи. Экспрессия PDGFR-б уменьшалась в периваскулярных инфильтратах и между пучками коллагеновых волокон.
При статистическом анализе установлено, что количество TGF-в1+ клеток после лечения незначительно возрастало (P=0,138), тогда как количество TGF-вRI+ и PDGFR-б+ клеток достоверно уменьшалось (табл. 3, рис. 4).
TGF-в1+ TGF-вRI+ PDGFR-б+
(P=0,138) (P=0,005) (P=0,005)
Рисунок 4. Динамика содержания TGF-в1+, TGF-вRI+ и PDGFR-б+ клеток в очагах ограниченной склеродермии в процессе лечения (количество клеток в 1 поле зрения, медианы, n=10)
При сравнении после лечения содержания TGF-в1+ и TGF-вRI+ клеток в коже больных с аналогичными показателями в коже здоровых добровольцев статистически значимых различий не установлено (соответственно P=0,129 и P=0,791), однако содержание PDGFR-б+ клеток оставалось повышенным (P=0,001).
В литературе имеется лишь одна работа, в которой был проведен анализ содержания TGF-в1 в коже больных ограниченной склеродермией до и после курса УФА-1 терапии, однако статистически значимых изменений не обнаружено (Kreuter A. и соавт., 2006). Исследований, посвященных изучению изменений содержания рецепторов TGF-в1 и PDGF под действием ультрафиолетового излучения УФА-1 диапазона, в доступной литературе нам не встретилось. Согласно полученным нами данным, УФА-1 терапия приводила к уменьшению исходно повышенного количества рецепторов I типа трансформирующего фактора роста бета и альфа-рецепторов тромбоцитарного фактора роста в очагах поражения. Учитывая важную роль указанных рецепторов в формировании фиброза кожи, можно заключить, что снижение их уровня в процессе фототерапии свидетельствует о патогенетическом характере действия данного вида лечения.
ВЫВОДЫ
1. Терапия низкими и средними дозами длинноволнового ультрафиолетового излучения УФА-1 диапазона является эффективным методом лечения больных ограниченной склеродермией: положительный эффект наблюдается у 90,2% больных, клиническое выздоровление и значительное улучшение - соответственно у 7,8% и 47,1% пациентов. Под действием УФА-1 излучения значительно уменьшаются основные клинические симптомы заболевания - эритема и индурация кожи.
2. После курса УФА-1-терапии в очагах склеродермии наблюдаются уменьшение атрофии эпидермиса с формированием межсосочковых выростов, регрессия вакуольной дистрофии в базальных кератиноцитах и эпидермального экзоцитоза лимфоцитов, уменьшение периваскулярных инфильтратов, частичное восстановление нормальной структуры коллагеновых волокон, особенно выраженное в нижних отделах дермы, увеличение количества сосудов и придатков кожи.