Для определения терапевтической эффективности у каждого больного рассчитывали процент уменьшения клинических симптомов: интенсивности эритемы, интенсивности индурации, а также площади индурации, после чего рассчитывали процент уменьшения поражения кожи. За клиническое выздоровление принимали уменьшение поражения кожи на 95% и более, значительное улучшение - 51-94%, улучшение - 25-50%, отсутствие эффекта - менее, чем на 25%. С целью статистической обработки результаты терапии выражали в виде балла эффективности лечения: 3 балла соответствовало клиническому выздоровлению, 2 - значительному улучшению, 1 - улучшению, 0 - отсутствию эффекта.
У 10 больных до и после курса УФА-1 терапии проведены гистологические, гистохимические и иммуноморфологические исследования кожи. Биоптаты кожи до лечения брали из очагов уплотнения, после лечения - из участков ранее поражённой кожи, расположенных рядом с местом предыдущей биопсии. Иммуноморфологические исследования проводили также у 10 здоровых добровольцев (группа контроля), у которых биоптаты кожи брали при проведении косметических операций.
Биоптаты кожи подвергали стандартной гистологической обработке: фиксировали в 10% растворе забуференного формалина, осуществляли гистологическую проводку путем обезвоживания в этиловом спирте и заливки в парафин. Для проведения гистологического и гистохимического исследования срезы окрашивали гематоксилин-эозином, по методу Вейгерта и толуидиновым синим.
Для проведения иммуноморфологических исследований использовали мышиные моноклональные антитела производства фирмы «Novocastra Laboratories Ltd» (Великобритания), специфичные к CD4 - маркеру субпопуляции Т-хелперов/индукторов, CD8 - маркеру субпопуляции супрессорно-цитотоксических Т клеток, CD25 - маркеру -цепи рецептора ИЛ-2, HLA-DR - молекуле главного комплекса гистосовместимости II класса. Исследование содержания профиброзных цитокинов проводили с использованием антител, специфичных к TGF-в - маркеру трансформирующего фактора роста бета 1 производства фирмы «Visionbiosystems novocastra» (Великобритания), TGF-вRI - маркеру рецептора I типа трансформирующего фактора роста бета 1 производства «Visionbiosystems novocastra» (Великобритания), PDGFR-б - маркеру альфа-рецептора тромбоцитарного фактора роста производства «NeoMarkers Thermo Fisher Scientific» (США).
Для визуализации иммуноморфологической реакции использовали стрептавидин-биотинилированные вторичные антитела Novocastra Peroxidase Detection System производства «Leica Microsystems» (Великобритания). Срезы расправляли на предметных стеклах с полилизиновым покрытием. Постановку реакции осуществляли согласно протоколам, прилагаемым к используемым моноклональным антителам. Высокотемпературную антигенную демаскировку проводили путем кипячения в цитратном буфере (рН - 6,0) в СВЧ-печи при максимальной мощности 900 Вт тремя циклами по 5 минут с 1-минутными перерывами. Остывшие препараты промывали в растворе ТРИС-буфера (рН -7,54-7,58), обрабатывали 0,3% раствором перекиси водорода на метаноле (1:1) для предотвращения эндогенной пероксидазной активности. Инкубацию с первичными антителами проводили в течение 60 минут при температуре 23°C, со вторичными антителами - в течение 30 минут при температуре 37°С. Для завершения окрашивания осуществляли фоновое контрастирование биоптатов гематоксилином Майера.
Полученные гистологические, гистохимические и иммуногистохимические препараты заключали под покровное стекло и изучали с помощью светового микроскопа Leica DM4000В (Германия), изображение документировали цифровой камерой Leica DFC320 (Германия).
Содержание CD4+, CD8+ и CD25+ клеток в эпидермисе определяли из расчета на 100 эпителиоцитов базального слоя. При оценке содержания CD4+, CD8+, CD25+ клеток в дерме в 5 периваскулярных инфильтратах произвольно выбирали по 20 клеток, среди которых проводили подсчет количества клеток, меченных указанными антителами, после чего для каждого биоптата рассчитывали средние значения их относительного содержания. Определение содержания HLA-DR+ клеток осуществляли с использованием программы «Adobe Photoshop'CS» (версия 8). Для этого в пикселях измеряли площадь поля зрения и площадь окрашенных клеток, затем высчитывали процентное отношение площади окрашенных клеток к площади поля зрения. Экспрессию TGF-в1+, TGF-вRI+ и PDGFR-б+ клеток в дерме оценивали путем определения количества окрашенных клеток в 1 поле зрения. Подсчет количества клеток осуществляли в 5 произвольно выбранных полях зрения, после чего для каждого биоптата рассчитывали средние значения.
Статистический анализ проводили с применением пакета прикладных программ Statistica'99 (StatSoft, США) и SPSS 16 (SPSS, Inc., США). Проверка на нормальность распределения осуществлялась с помощью критерия Шапиро-Уилкса. Описание распределений количественных и порядковых признаков в выборках представляли в виде медиан и границ интерквартильных отрезков, качественных признаков - в виде абсолютных и относительных частот. При сравнении показателей до и после лечения внутри групп использовали тест Вилкоксона, при сравнении групп друг с другом - U-критерий Манна-Уитни. Сравнение групп по качественным признакам проводили с использованием теста Хи-квадрат и точного критерия Фишера. Оценка корреляционных связей осуществлялась с помощью коэффициентов ранговой корреляции Спирмена. Критическим уровнем значимости было выбрано значение P<0,05.
Результаты исследования
Изучение эффективности терапии больных ограниченной склеродермией низкими и средними дозами УФА-1 излучения. Клиническая характеристика наблюдавшихся пациентов представлена в таблице 1. УФА-1 терапия проведена 51 больному в возрасте от 11 до 65 лет. Продолжительность заболевания у них варьировала от 3 месяцев до 10 лет. Бляшечной формой страдали 46 (90,2%) больных, линейной - 2 (3,9%), экстрагенитальным склероатрофическим лихеном - 3 (5,9%). Начальные дозы УФА-1 облучения варьировали от 5 до 20 Дж/см2 (медиана 5), максимальные дозы - от 20 до 40 Дж/см2 (медиана 30), курсовые дозы - от 321 до 1939 Дж/см2 (медиана 525). На курс пациенты получали от 15 до 60 процедур (медиана 27).
Группу сравнения составили 24 больных (20 женщин, 4 мужчин) в возрасте от 9 до 73 лет, с длительностью заболевания от 3 месяцев до 42 лет, которым проводилось лечение медикаментозными средствами. Бляшечной формой склеродермии страдали 20 больных (83,3%), линейной - 2 (8,3%), склероатрофическим лихеном - 2 (8,3%). При сравнении исходных значений клинических показателей в группах больных статистических различий по полу, возрасту, длительности и формам заболевания, а также интенсивности эритемы, интенсивности индурации и площади индурации не выявлено (P>0,05).
Анализ полученных результатов показал высокую эффективность УФА-1 терапии (рис. 1). Применение низких и средних доз УФА-1 излучения оказалось эффективным при всех наблюдавшихся формах заболевания. Клиническое выздоровление достигнуто у 4 (7,8%) пациентов, значительное улучшение - у 24 (47,1%), улучшение - у 18 (35,3%); эффект отсутствовал у 5 (9,8%) больных (табл. 2).
В процессе лечения статистически значимой динамике подвергались все изучавшиеся клинические симптомы склеродермии (рис. 2, 3). Медианы интенсивности эритемы, интенсивности индурации и площади индурации пораженной кожи после лечения уменьшились соответственно на 78% (P<0,001), 57,2% (P<0,001) и 10,4% (P<0,001).
В группе медикаментозного лечения клиническое выздоровление достигнуто у 1 (4,2%) больного. Значительное улучшение констатировано у 5 пациентов (20,8%), улучшение - у 4 (16,7 %), эффект отсутствовал у 14 (58,3%). После проведенной терапии медианы интенсивности эритемы и индурации пораженной кожи уменьшились соответственно на 24% (P=0,014) и 40,6% (P=0,157), а площадь индурации увеличилась на 9,4% (P=0,073).
При сравнении результатов в группах больных с использованием критерия Манна-Уитни балл эффективности лечения в группе УФА-1 терапии (3,0 [2,0; 3,0]) оказался статистически значимо выше, чем в группе медикаментозного лечения (1,0 [1,0; 3,0]; P=0,001). Продолжительность лечения в группе УФА-1 терапии, наоборот, оказалась меньше (2,0 [1,0; 3,5] месяцев), чем в группе сравнения (9,0 [6,3; 14,0] месяцев; P<0,001).
Интересно отметить, что при корреляционном анализе в группе УФА-1 терапии выявлена статистически значимая корреляционная связь процентов уменьшения интенсивности эритемы и индурации кожи (r=0,41, P=0,02), тогда как в группе сравнения такой зависимости не обнаружено.
УФА-1 терапия в целом хорошо переносилась больными. Побочные эффекты отмечены у 8 (15,7%) больных: 4 (7,8%) пациента отмечали сухость кожи, 2 (3,9%) - чувство жара, 1 (2%) - повышение артериального давления. У 1 больной (2%) к концу курса фототерапии появились пузыри в отдельных очагах поражения, которые разрешились после временной отмены процедур. Ни у одного больного в процессе лечения не наблюдалось развития эритемы. У большинства пациентов к концу курса облучений формировалась фотоиндуцированная пигментация кожи, исчезавшая спустя несколько месяцев после окончания лечения.
В процессе медикаментозного лечения побочные эффекты наблюдали у 9 (37,5%) пациентов: у 8 (33,3%) больных отмечены токсико-аллергические реакции, у 6 (25%) - контактный дерматит, у 4 (16,7%) - диспепсические явления.
Рисунок 2. Динамика интенсивности эритемы и индурации в очагах ограниченной склеродермии в процессе лечения (баллы, медианы и квартили)
Отдаленные результаты в группе УФА-1 терапии прослежены у 30 пациентов, в группе медикаментозного лечения - у 18. Установлено, что достигнутое в процессе лечения улучшение сохранялось в течение 1 года соответственно у 27 (90%) и 12 (66,7%) больных, в течение 2 лет - соответственно у 13 (43,3%) и 6 (33,3%).
Рисунок 3. Изменение площади индурации в очагах ограниченной склеродермии в процессе лечения (см2, медианы и квартили)
Таким образом, разработанный метод УФА-1 терапия является эффективным и хорошо переносимым методом лечения больных бляшечной и линейной склеродермией, а также экстрагенитальным склероатрофическим лихеном. Применение данного метода приводит к регрессу основных клинических симптомов заболевания - эритемы и индурации кожи, что свидетельствует о его противовоспалительном и антифиброзном действии.
Изучение динамики морфологических изменений кожи в очагах склеродермии после курса УФА-1 терапии (по данным световой микроскопии).
Гистологические, гистохимические и иммуноморфологические исследования кожи проведены у 10 больных ограниченной склеродермией (4 мужчин и 6 женщин) в возрасте от 23 до 57 лет (медиана 27,5 лет) и длительностью болезни от 5 месяцев до 17 лет (медиана 1,5 года) и 10 здоровых добровольцев (5 мужчин и 5 женщин) в возрасте от 29 до 64 лет (медиана 45,5 лет). У всех больных диагностирована бляшечная форма заболевания в стадии эритемы и индурации. Группа больных не отличалась по возрасту и полу от группы здоровых добровольцев (P>0,05).
Все исследования у больных были проведены до и после курса УФА-1 терапии. На курс больные получали от 20 до 40 процедур (медиана 30 процедур). Максимальные дозы облучения варьировали от 20 до 40 Дж/см2 (медиана 30 Дж/см2), курсовые дозы - от 510 до 1939 Дж/см2 (медиана 648 Дж/см2). В результате проведенной терапии положительный эффект констатирован у 9 из 10 больных: клиническое выздоровление достигнуто у 1 пациента, значительное улучшение - у 4, улучшение - у 4. В процессе лечения в очагах склеродермии наблюдали уменьшение интенсивности как эритемы (P=0,005), так и индурации кожи (P=0,011); площадь индурации сократилась на 22% (P=0,011).
При гистологическом исследовании биоптатов кожи больных до лечения эпидермис имел неравномерную толщину с участками атрофии, в нем выявляли небольшой гиперкератоз, вакуольную дистрофию и гиперпигментацию базальных кератиноцитов, экзоцитоз единичных лимфоцитов в эпидермис. В дерме обнаруживали сглаженность дермальных сосочков, уплотнение коллагеновых волокон с признаками гомогенизации и гиалинизации, интерстициальный отек и периваскулярные инфильтраты преимущественно лимфо-гистиоцитарного характера, уменьшение общего количества капилляров и атрофию придатков кожи. При дополнительной окраске по Вейгерту отмечали выраженное нарушение структуры эластических волокон в виде их истончения, фрагментации и комкования. Изменения структуры эластических волокон были особенно заметны в местах выраженного уплотнения коллагеновых волокон; в отдельных участках они полностью отсутствовали. При окраске толуидиновым синим в инфильтратах обнаруживали умеренное количество тканевых базофилов в фазе дегрануляции.
После курса УФА-1 терапии наблюдали уменьшение атрофических изменений в эпидермисе с формированием межсосочковых выростов, отсутствие вакуольной дистрофии в базальных кератиноцитах и эпидермального экзоцитоза лимфоцитов, частичное восстановление нормальной структуры коллагеновых волокон, особенно выраженное в нижележащих отделах дермы, уменьшение периваскулярных инфильтратов, увеличение количества сосудов и придатков кожи. При окраске по Вейгерту обнаруживали частичное восстановление нормальной структуры эластических волокон. При окраске толуидиновым синим в инфильтратах находили лишь единичные тканевые базофилы.
Таким образом, у больных ограниченной склеродермией после курса УФА-1 терапии наряду с улучшением клинической картины заболевания наблюдалось уменьшение морфологических нарушений в коже.
Изучение влияния УФА-1 терапии на клеточные иммунные механизмы в коже больных ограниченной склеродермией. Иммуномофрологические исследования препаратов кожи с антителами CD4 и CD8 показали, что в группе здоровых добровольцев CD4+ и CD8+ лимфоциты в эпидермисе отсутствовали, а в дерме встречались лишь единичные клетки. В эпидермисе больных CD4+ лимфоциты также не обнаруживали, тогда как отдельные CD8+ лимфоциты находили в большинстве исследованных препаратов, нередко они располагались вблизи базального слоя эпидермиса в тесном контакте с эпителиоцитами. В дерме СD4+ клетки находили лишь в периваскулярных инфильтратах, СD8+ лимфоциты встречались как в составе периваскулярных инфильтратов, так и в виде отдельных клеток, располагавшихся в сосочковом слое дермы.