Автореферат: Структурно-функциональные свойства эритроцитарных мембран при дислипопротеинемиях

Как показало проведенное нами исследование, в мембранах эритроцитов у больных СД угнетена активность Na⁺,K⁺-ATФазы (табл. 3). Не исключено, что ингибирование активности Na⁺,K⁺-ATФазы является результатом выявленной структурной модификации липидного матрикса мембран эритроцитов. Общепринятой является точка зрения о том, что регулирующая роль липид-белковых взаимодействий для Na⁺,K⁺-ATФазы сводится к обеспечению ее каталитических функций и переходов между различными конформационными состояниями посредством поддержания определенной микровязкости мембраны, а также за счет взаимодействия заряженных боковых цепей этих ферментов с полярными головками мембранных липидов [Грибанов Г.А., 1991; Зелинский Б.А., 1994; Успенская Ю.А., 2002].

Рассматривая механизмы структурной модификации мембраны эритроцитов, важно отметить множественность внутри- и внеклеточных эффекторов, которые могут индуцировать друг друга или оказывать свое влияние изолированно. При СД имеют значение гипергликемия, стадия ее компенсации, активация свободно-радикального окисления и недостаточность антиоксидантных систем, а также нарушения липидного обмена. В частности известно, что липопротеины как одна из регуляторных систем организма имеет значение для поддержания структурного гомеостаза клеточных мембран. Нарушение транспорта липидов может привести к срыву реакций адаптации и формированию необратимых нарушений в мембранах. Именно поэтому изучение изолированного действия липопротеинов на мембрану эритроцитов в опытах in vitro представилось нам весьма интересным.

Выше было указано на важную роль липопротеинов в обновлении мембранных компонентов, причем ЛПВП, ЛПНП и ЛПОНП могут оказывать разнонаправленные эффекты, меняя тем самым структурно-функциональные свойства мембраны. Некоторые авторы предполагают факт возникновения комплекса эритроцит-липопротеин, в котором и происходит свободная диффузия ХС [Болдырев А.А., 1990]. Изучая спектральные характеристики взаимодействия липотропного зонда пирен с мембраной эритроцитов крыс до и после инкубации мембранной взвеси с липопротеинами основных классов (ЛПВП, ЛПНП и ЛПОНП), мы обнаружили модифицирующее влияние, проявляющееся в изменении текучести липидной фазы и характера белок-липидных взаимодействий (табл. 4). Очевидно, что образование комплекса липопротеин-мембрана сопровождается кратковременными локальными изменениями физико-химических свойств бислойной структуры, которые способствуют молекулярному обмену липидов. Сформировавшийся комплекс, вероятно, представляет собой особую структуру с существованием раздела фаз, преодолевать который помогают силы гидрофобного взаимодействия.

Таблица 4

Результаты флуоресцентного зондирования флуорофором пирен мембраны эритроцитов у крыс при инкубации с липопротеинами высокой плотности (ЛПВП), липопротеинами низкой плотности (ЛПНП) и липопротеинами очень низкой плотности (ЛПОНП), Me(Q₁-Q₃)

Примечание: р - уровень значимости различий по сравнению со значениями параметров, характеризующих состояние мембран эритроцитов у крыс до инкубации с липопротеинами

Ранее отмечалось, что мембрану ХС покидает в этерифицированном виде. Будучи менее полярными соединениями, эфиры ХС легче проходят через границу раздела фаз, где связываются с ЛПВП и подвергаются дальнейшему метаболизму. Возможно, приток ХС от ЛПНП и ЛПОНП в мембрану проходит похожим образом, только в обратном направлении. Важное значение в этих перемещениях имеют входящие в состав липопротеинов апобелки. Известно, что белки снижают энергию активации, необходимую для десорбции липидов в жидкую фазу, тем самым облегчая процесс переноса амфипатной молекулы [Sprong H., 2001]. Кроме того, особенности строения аполипопротеинов, высокая степень спирализации структуры и наличие амфипатных областей, ответственных за связывание с липидами, обусловливает их детергентные свойства [Поляков Л.М., Панин Л.Е., 2000]. На наш взгляд, изучение влияния очищенных аполипопротеинов (А-I, С и Е) при ДЛП является закономерным продолжением исследования механизмов модификации мембраны эритроцитов. Нами были обнаружены принципиальные различия воздействия этих апобелков. В частности, аполипопротеин А-I, наибольшее количество которого присутствует в ЛПВП, оказывал «разжижающее» действие на мембрану эритроцитов. Об этом свидетельствовали достоверное повышение отношения интенсивностей флуоресценции димерной и мономерной форм флуорофора пирен (J₄₇₀/J₃₇₀) после инкубации с раствором апобелка как при длине волны возбуждающего света 340 нм (значения коэффициента до инкубации составили 0,240 (0,237-0,253) усл. ед., после - 0,353 (0,318-0,403) усл.ед. при, p<0,05), так и при 285 нм (значения коэффициента до - 0,167 (0,159-0,190) усл. ед., после инкубации составили 0,283 (0,214-0,322) усл.ед., p<0,05). При этом в мембране изменялся характер белок-липидных взаимодействий. Медиана величины миграции энергии с триптофана на пирен увеличилась с 42,63 (40,00-43,75) % до и до 46,06 (44,64-47,62) % - после инкубации (p<0,05).

Известно, что апо A-I способен связывать свободный ХС, являясь очень сильным его акцептором, и опосредует его обратный транспорт в печень. По данным А.Н. Климова и соавт. [1984, 1992], стерин способен образовывать комплексы с апопротеином A-I без вовлечения ФЛ. При этом образование комплекса происходит путем взаимодействия холестеринового гидроксила с гуанидиновыми и е-аминогруппами аминокислотных остатков белка. При этом происходит уменьшение содержания ХС в мембране, что сопровождается увеличением количества связанной воды и снижением жесткости липидного бислоя.

Иное влияние оказывает на мембрану аполипопротеин С. Исследование интенсивности флуоресценции димерной и мономерной форм флуорофора пирен (J₄₇₀/J₃₇₀) при длине волны возбуждающего света 285 нм выявило снижение значения коэффициента эксимеризации, свидетельствующее об увеличении жесткости мембраны в зоне белок-липидных взаимодействий. Значения изучаемого параметра до инкубации с апо С составили 0,200 (0,166-0,250) усл. ед., после инкубации - 0,174 (0,118-0,214) усл. ед. Величина соотношения интенсивностей флуоресценции мономеров пирена (J₃₇₀/J₃₉₀) при л_в=340 нм после взаимодействия с апо С оказалась достоверно ниже и составила 0,763 (0,703-0,784) усл. ед. (при 0,831 (0,772-0,950) усл.ед. до инкубации p<0,05). Функциональные особенности апо С позволяют нам предположить возможный механизм подобного взаимодействия: скорее всего, выявленный эффект обусловлен связыванием аполипопротеином жирнокислотных хвостов фосфолипидов [Панин Л.Е. и соавт., 2001].

Наряду с этим оказалось, что аполипопротеин Е не изменяет спектральные характеристики взаимодействия мембраны эритроцита с зондом пирен, обнаруживая свою химическую инертность по отношению к липидному бислою в условиях нашего эксперимента. Известно, что апо Е также, как и апо A-I, является сильным акцептором ХС. Однако отсутстсвие изменений биофизических свойств мембраны после инкубации с этим аполипопротеином позволяет думать, что для влияния на структуру мембран необходимы какие-то другие дополнительные факторы.

Таким образом, состояние липидной фазы мембран эритроцитов обеспечивается внутриклеточными и внеклеточными механизмами регуляции (рис. 4). Для эритроцита - безъядерной клетки - среди внутриклеточных механизмов имеют значение прежде всего процессы свободно-радикального окисления ненасыщенных жирных кислот, фосфолиполиз, транслокация липидных молекул в мембранах и др. Среди плазменных факторов, влияющих на метаболизм липидов мембран эритроцитов, рассматривается значение липопротеинов как структур с аналогичной молекулярной организацией.

По результатам нашего исследования, у пациентов с сахарным диабетом параметры микровязкости мембран эритроцитов были взаимосвязаны с показателями липидного обмена, что подтверждалось данными корреляционного анализа. Кроме того, выделенные клинические группы больных СД 1, различавшиеся по степени выраженности нарушений липидного обмена, отличались и по степени выраженности структурной дезорганизации мембран эритроцитов. У пациентов с СД 2 закономерности изменения структурных свойств мембраны красных клеток крови оказались сложнее и зависели от характера нарушения липидного обмена. Факт взаимодействия мембран эритроцитов с липопротеинами был продемонстрирован экспериментально, при этом мембранотропным эффектом обладали и аполипопротеины.

ВЫВОДЫ

1. Нарушения структуры мембран эритроцитов у больных сахарным диабетом типа 1 и 2 с дислипопротеинемиями характеризуются изменениями липидного состава (увеличение содержания холестерина и его эфиров, лизофосфолипидов, фосфатидилсерина при одновременном уменьшении доли фосфатидилхолина) и микровязкости липидного бислоя, нарушением межмолекулярных липид-липидных и белок-липидных взаимодействий, а также угнетением активности Na⁺,K⁺-АТФазы.

2. Изменения микровязкости мембран эритроцитов, нарушение липид-липидных и белок-липидных взаимодействий у больных сахарным диабетом типа 1 и 2 коррелируют с увеличением содержания липопротеинов низкой и очень низкой плотности в сыворотке крови. Низкое содержание липопротеинов высокой плотности является дополнительным фактором, усугубляющим нарушения структуры мембран эритроцитов.

3. Нарушения липопротеинового состава крови и степень дезорганизации мембран эритроцитов при сахарном диабете типа 2 более выражены, чем при сахарном диабете типа 1. Выраженность указанных изменений при сахарном диабете типа 1 зависит от длительности заболевания, наличия декомпенсации углеводного обмена и сосудистых осложнений.

4. Инкубация мембран эритроцитов с липопротеинами низкой и очень низкой плотности в опытах in vitro приводит к выраженным наноструктурным изменениям и сопровождается изменениями липид-липидных и белок-липидных взаимодействий, снижением микровязкости эритроцитарных мембран.

5. Изменения структурных свойств теней эритроцитов крыс под влиянием аполипопротеина A-I и липопротеинов высокой плотности, обладающих свойством акцептировать мембранный холестерин, в опытах in vitro имеют одинаковую направленность и проявляется уменьшением микровязкости липидной фазы мембран эритроцитов.

6. Аполипопротеины С вызывают увеличение жесткости анулярной зоны мембран эритроцитов и уменьшение их полярности . Аполипопротеин Е в опытах in vitro не оказывает мембранотропного эффекта на тени эритроцитов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бутусова В.Н., Ананина Е.А. Феноменология модификации плазматической мембраны клеток при дислипидемии // VI международный конгресс молодых ученых и специалистов «Науки о человеке», г. Томск, 20-21 мая 2005 г. - Томск, 2005. - С.2-3.

2. Бутусова В.Н., Рязанцева Н.В., Кравец Е.Б, Яковлева Н.М., Кощевец Т.Ю., Ананина Е.А., Жаворонок Т.В., Биктасова А.К. Особенности структуры и функции мембраны эритроцитов у больных сахарным диабетом с сопутствующей гиперхолестеринемией // Материалы научно-практической межрегиональной конференции, посвященной 70-летию ГОУ ВПО Новосибирской государственной медицинской академии «Актуальные проблемы современной эндокринологии». - Новосибирск: Изд-во НГТУ. - 2005. - С. 88-89.

3. Кравец Е.Б., Рязанцева Н.В., Яковлева Н.М., Бутусова В.Н., Тухватулин Р.Т., Новикова Л.К. Молекулярные нарушения мембраны эритроцитов при сосудистых осложнениях сахарного диабета типа 1 // Сахарный диабет. - 2006. - № 1. - С. 10-17.

4. Яковлева Н.М., Рязанцева Н.В., Бутусова В.Н. Изменения структурно-функционального статуса мембраны эритроцитов при сосудистых осложнениях сахарного диабета типа 1 // XI Всероссийская научно-практическая конференция «Молодые ученые в медицине», г. Казань, 26-27 апреля 2006 г. - Казань: ЗАО « Новое знание», 2006. - С.189.

5. Новицкий В.В., Рязанцева Н.В., Степовая Е.А., Федорова Т.С., Кравец Е.Б., Иванов В.В., Жаворонок Т.В., Часовских Н.Ю., Чудакова О.М., Бутусова В.Н., Яковлева Н.М. Молекулярные нарушения мембраны эритроцитов при патологии разного генеза являются типовой реакцией организма: контуры проблемы // Бюллетень сибирской медицины. - 2006. - № 2. - С. 62-67.

6. Кравец Е.Б., Рязанцева Н.В., Яковлева Н.М., Бутусова В.Н., Чудакова О.М., Сапрыкина Э.В. Молекулярные нарушения мембран эритроцитов и тромбоцитов при сосудистых осложнениях сахарного диабета типа 1 // Бюллетень сибирской медицины. - 2006. - № 4. - С. - 33-41.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Апо - аполипопротеин

ДЛП - дислипопротеинемия

ЛПВП - липопротеины высокой плотности

ЛПНП - липопротеины низкой плотности

ЛПОНП - липопротеины очень низкой плотности

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СД 1 - сахарный диабет типа 1

СД 2 - сахарный диабет типа 2

ТГ - триацилглицериды